腹主动脉瘤病人血清和组织中Notch1和T细胞激活分泌调节因子的表达及其意义

李光泽 张济 林昌俭 俞慎林 包平倩

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)定义为腹主动脉局部扩张超过正常直径的1.5倍，是一种老年人群的慢性退行性疾病，与炎性反应密切相关[1]。AAA早期无明显症状，早期诊断指标有限，在发现时病人出现破裂和血栓的风险大大提高[2]。Notch通路是细胞内调控细胞免疫和炎性反应的关键通路，Notch被激活后可通过促进细胞中泌白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6以及凋亡蛋白的分泌，从而引起血管重塑[3]。T细胞激活分泌调节因子(reduced upon activation mormal T expression and secreted，RANTES)是一种由血管细胞分泌的趋化因子配体，具有促进炎症影响血管结构和功能的作用，参与血压引起血管病变以及动脉粥样硬化等[4]。本文分析Notch1和RANTES在AAA病人血清和组织中的表达及其意义。

对象与方法

一、对象

2019年1月～2021年1月于我院接受手术治疗的AAA病人41例作为AAA组，年龄45～80岁，平均年龄(59.4±4.4)岁，男23例，女17例，吸烟史15例，高血压18例，糖尿病8例。所有病人均保存外周血液标本，在手术过程中收集AAA组织和AAA旁距病灶3 cm以上的正常腹主动脉组织。同时选择在我院进行体检的健康志愿者41例作为健康组，年龄44～78岁，平均(58.7±4.5)岁，男22例，女18例，吸烟11例，高血压12例，糖尿病5例。两组一般资料比较差异无统计学意义。本研究经我院伦理委员会批准。纳入标准：年龄45～80岁；CT血管造影符合AAA的诊断标准[5]；首次发病；病人均签署知情同意书。排除标准：合并全身性感染；合并精神异常、意识障碍；合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、血液学疾病；资料不全。

二、方法

1.RT-qPCR检测：提取外周血中总RNA，逆转录，条件：37 ℃/15分钟；98 ℃/5分钟。使用BestarTMqPCR试剂盒(DBI Bioscience公司，德国)进行qPCR实验，条件如下：95 ℃ 2分钟， 94 ℃ 20秒，58 ℃ 20秒，72 ℃ 20秒，40个循环，72 ℃下延伸4分钟。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行RT-qPCR分析。通过比较循环阈值并以GAPDH作为内参计算Notch1 mRNA的相对表达水平。Notch1上游引物：5'-TCAGCGGGATCCACTGTGAG-3'，下游引物：5'-ACACAGGCAGGTGAACGAGTTG-3'，GAPDH上游引物：5'-TGAGGCTGGAAGTGGAAG-3'，下游引物：5'-CTTTAGGGTAGTGGTAGAAG-3' 。

2.ELISA检测：外周血离心(2 000 rpm，20分钟)收集血清。根据试剂盒说明书加入抗体和显色剂进行反应，利用酶标仪检测450 nm吸光度，根据标准曲线计算RANTES的浓度。

3.Western blot检测：组织裂解后4 ℃，12 000 rpm离心5分钟，收集总蛋白。8% SDS-PAGE分离样品中等量(50 μg)的蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。室温下将膜浸入5%脱脂牛奶中2小时封闭非特异性抗原。将膜分别与anti-Notch1和anti-RANTES在4 ℃下孵育过夜，将膜与相应的二抗室温下孵育1小时。使用化学发光试剂盒进行显色，使用Quantum One软件分析灰度计算蛋白相对于GAPDH的表达量。

三、统计学处理

结果

1.血清中Notch1 mRNA和RANTES水平比较： AAA病人血清中Notch1 mRNA和RANTES水平均高于健康组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 血清中Notch1 mRNA和RANTES水平比较

2.Notch1和RANTES蛋白在AAA组织中的表达：AAA组织中的Notch1和RANTES蛋白表达水平高于正常的腹主动脉组织，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表2。

图1 Western blot检测AAA组织和主动脉组织中Notch1和RANTES蛋白表达水平

表2 AAA组织和主动脉组织中Notch1和RANTES蛋白相对表达水平

3.Notch1和RANTES在血清和组织中的相关性：AAA病人组织Notch1蛋白水平和血清Notch1 mRNA水平正相关(r=0.485,P=0.025)；组织中RANTES蛋白水平与血清RANTES浓度正相关(r=0.506,P=0.016)。见图2。

图2 Notch1和RANTES在血清和组织中的相关性

4.AAA中Notch1与RANTES的相关性：在AAA病人组织和血清中，Notch1和RANTES表达均呈正相关(r血清=0.515,P=0.014；r组织=0.537,P=0.008)。见图3。

图3 AAA中Notch1与RANTES的相关性

讨论

目前，治疗AAA的方法仍主要为对症治疗。有研究表明，炎性反应参与AAA的发生和发展进程，且免疫细胞的浸润和血管凋亡促进AAA疾病进展[6]。

Notch通路是诱导促炎基因转录的关键通路，在炎性进程中，Notch1蛋白过表达，其剪切下的NICD片段会进入细胞核诱导转录的激活，促进IL-6和TNF-α等的表达和分泌[7]。RANTES也称为CC趋化因子配体5(CCL5)，是炎症细胞的重要化学引物，与动脉的粥样硬化发病机制有关[8]。RANTES可以由血管细胞和脂肪组织的常驻细胞产生，体外添加的血管紧张素Ⅱ会增加RANTES在小动脉和小静脉内皮中的表达，而RANTES在血管周围炎症的发生中起关键作用，并引起高血压相关的血管功能障碍[9]。本次研究主要分析Notch通路和RANTES是否参与了AAA的发生和发展，结果表明AAA病人血清中Notch1 mRNA和RANTES的水平显著高于健康者，且AAA组织中的Notch1和RANTES蛋白水平也显著高于正常AAA组织。此外，AAA组织中的Notch1和RANTES水平与血清正相关。本次研究结果初步表明，Notch1和RANTES的过表达可能参与了AAA的发生或发展，并且组织中的Notch1和RANTES水平可反应在血清中，提示检测血清中Notch1和RANTES的水平可能是早期辅助诊断AAA的可行的指标。但是关于Notch1和RANTES在AAA中的临床意义仍需要扩大样本分析。

T淋巴细胞和组织中浸润的巨噬细胞也参与AAA的发生和发展，它们会响应各种环境因素而发生表型变化，从而分泌细胞因子导致血管重塑[10-11]。Notch通路不但会促进T淋巴细胞分泌炎性因子，还会促进巨噬细胞向M1表型转化，M1表型巨噬细胞会分泌IL-6和TNF-α等引起血管内皮细胞损伤、凋亡[12]。而Notch通路也会促进免疫细胞中RANTES的表达，从而进一步激活炎性反应[13]。本研究中，AAA病人血清和组织中Notch1和RANTES均呈现正相关，初步说明了Notch1和RANTES存在共同促炎的作用。文献报道提示，Notch1可能通过促进RANTES的表达促进炎性反应，进而参与AAA[14]。然而，Notch1促进RANTES表达的机制仍需要进一步的细胞定位的方法验证Notch1与RANTES表达在AAA组织中的何种细胞，从而进一步分析Notch1和RANTES参与AAA的机理。

综上所述，AAA病人血清和组织中的Notch1和RANTES均过表达，且二者正相关。检测血清Notch1 mRNA和RANTES水平对AAA早期诊断具有重要意义。