高效液相色谱法测定柴辛注射液中有效组分含量的研究

林灵超, 金 迁，陈卿卿，杜 强

(浙江福立分析仪器股份有限公司，浙江台州 317500)

柴辛注射液，主要处方组成为柴胡和细辛，具有解表退热、祛风散寒、镇痛抗炎的药效，在马、牛、羊、猪、犬等的感冒发热的治疗上被广泛使用[1-2]。柴辛注射液的现行质量控制标准收载于《兽药质量标准(2017年版，中药卷)》[3]中，为基于校正因子-气相色谱法对甲基丁香酚进行含量测定与控制，但易出现准确度低、峰型差、可操作性不强等缺点[4-5]。同时仅将甲基丁香酚作为柴胡的有效成分进行含量测定，忽略对细辛药效成分的分析，造成无法全面而准确地对柴辛注射液的质量控制做出评价，最终可能会导致因临床疗效的差异而产生对柴辛注射液价值的错误判断。

本文参考《中国药典》2020年版第一部细辛[6]及相关文献方法[7-14]，确定了以甲基丁香酚、细辛脂素为研究对象，建立了高效液相色谱法同时测定柴辛注射液中甲基丁香酚、细辛脂素含量的方法，为柴辛注射液产品质量的控制和质量标准的完善提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 主要试剂有：甲基丁香酚标准品(批号：111642-200301)，细辛脂素标准品(批号：111889-201705)，均购自于中国食品药品检定研究所；纯乙腈，色谱纯，购自于美国TEADIA；水，Millipore超纯水。

主要仪器有：LC5090型高效液相色谱系统，配置为自动进样器、输液泵、柱温箱、紫外检测器等，购自于浙江福立分析仪器股份有限公司；SQP型电子天平，购自于赛多利斯(上海)贸易有限公司产品；色谱分析柱Coreshell C18，5 μm，150 mm×4.6 mmID，购自于日本ChromaNik Technologies。

柴辛注射液，10 mL(相当于原生药30 g)，批号为20200502，山东德信生物科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制 分别精确称取甲基丁香酚和辛脂素标准品适量，用纯乙腈-纯水(5∶5, v/v)溶解配制成浓度为150 μg/mL的标准储备液。

临用前，用纯乙腈-纯水(5∶5, v/v)稀释成浓度为0.15、1.5、7.5、15、75、150 μg/mL的系列混合标准工作溶液。

1.3 供试品溶液配制 精密移取柴辛注射液供试品2 mL，置于50 mL容量瓶中，加纯乙腈-纯水(5∶5, v/v)稀释至刻度，过滤待进样。

1.4 高效液相色谱方法 色谱柱为Coreshell C18，5 μm，150 mm×4.6 mmID，流动相为纯乙腈-纯水(5∶5, v/v)，流量为1.0 mL/min，柱箱温度为40 ℃，紫外检测器检测波长为287 nm，进样量为5 μL。

2 结果与分析

2.1 专属性试验 依次注入混合标准溶液、供试品溶液及空白溶液。结果显示，混合标准溶液中甲基丁香酚和细辛脂素的保留时间分别为5.41 min、8.92 min；供试品溶液中甲基丁香酚和细辛脂素与混合对照品色谱峰的保留时间保持一致，分离度分别为5.5、1.6，理论塔板数分别为18123、26644，拖尾因子均为1.10，同时经光谱扫描得到峰纯度较高；空白溶液中，在甲基丁香酚和细辛脂素的保留时间位置均未见有杂质峰的干扰。

2.2 方法学试验

2.2.1 方法标准曲线、检测限和定量限 将上述系列混合标准工作溶液进样，测定各组分的峰面积。以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标(X)，不同浓度下所得峰面积为纵坐标(Y)，得甲基丁香酚、细辛脂素的拟合曲线分别为为Y=7243X-258，R2=0.9999；Y=18853X-676，R2=0.9999。结果表明在0.15～150 μg/mL质量浓度范围之内，甲基丁香酚、细辛脂素的溶液浓度与峰面积线性关系良好。

按照3倍噪音计算检测限，10倍噪音计算定量限，得到甲基丁香酚、细辛脂素的检测限为0.025 μg/mL、0.012 μg/mL，定量限为0.083 μg/mL、0.040 μg/mL。

2.2.2 精密度试验 取20200502号柴辛注射液适量，以纯乙腈-纯水(5∶5, v/v)稀释并定容得到供试品溶液，连续进样7次，记录甲基丁香酚、细辛脂素的峰面积值。结果得到甲基丁香酚、细辛脂素峰面积RSD分别为0.15%、0.20%，表明分析方法精密度良好。

图1 混合标准溶液(a)、供试品溶液(b)、空白溶液(c)

2.2.3 稳定性试验 取20200502号柴辛注射液适量，以纯乙腈-纯水(5∶5, v/v)稀释并定容得到供试品溶液，分别在0、2、6、12、24、48 h各进行测定，记录甲基丁香酚、细辛脂素的峰面积，其RSD分别为0.51%、0.42%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.2.4 加标回收率 取柴辛注射液适量，依次添加3个浓度水平的甲基丁香酚、细辛脂素混合标准溶液，后以纯乙腈-纯水稀释定容。每个浓度水平平行测定3份，计算平均回收率。结果显示，甲基丁香酚的平均回收率为97.47%～100.53%，RSD为0.92%～2.17%；细辛脂素的回收率为88.47%～92.23%，RSD为1.48%～3.55%，表明方法回收率良好。

2.2.5 样品检测 取平行配制的6份不同批次的柴辛注射液供试品溶液进样，依据线性拟合曲线，计算含量。结果每1 mL供试品中甲基丁香酚、细辛脂素的平均含量为43.37 μg、1.21 μg，RSD分别为0.52%、1.65%。

3 讨 论

目前对柴辛注射液中有效成分的检测，主要为校正因子-气相色谱法对甲基丁香酚进行含量测定，极易出现准确度低、峰型差、可操作性不强等缺点[3-6]，未见其他检测方法的报道。本研究选择甲基丁香酚、细辛脂素分别代表柴辛注射液的两剂处方柴胡、细辛的有效物质，通过高效液相色谱法同时进行其含量测定，以全面评价柴辛注射液的质量。

研究对甲基丁香酚、细辛脂素在210～370 nm的波长范围内进行波长扫描，虽然两者在230 nm也有较大吸收峰，但根据主成分的含量最终确定检测波长为287 nm。其次通过对比相同规格的Coreshell C18和其他全多孔型色谱柱，如Sunniest C18、Xtimate C18、Eclipse Plus C18、Wondasil C18等的效果，以保留时间、分离度、拖尾因子、理论塔板数等参数做为评价指标，得到当使用Coreshell C18色谱柱时甲基丁香酚峰、细辛脂素的理论塔板数最高、分离度最大、最低检出限最低、分析速度最短，因此确定Coreshell C18为本研究的色谱柱，此时分析方法具有更好的分离、更高的灵敏度和更快的分析速度的优点，可以有效节省洗脱溶剂、降低分析成本。最后根据甲基丁香酚、细辛脂素的性质，分别对比了甲醇-纯水、乙腈-纯水等洗脱体系作流动相时的分离效果。使用纯甲醇作有机溶剂时，随着纯甲醇的组成比例的增加，流动相洗脱强度增加，甲基丁香酚峰会与溶剂峰共洗脱，同时细辛脂素与杂质干扰物的分离度下降；当纯甲醇的组成比例逐渐降低，溶剂峰拖尾会增大，将甲基丁香酚峰包覆在溶剂峰中；所以纯甲醇-纯水作洗脱体系时，无法实现甲基丁香酚、细辛脂素的有效分离和准确定量；当使用纯乙腈作有机溶剂时，溶剂峰的峰宽明显缩小。当纯乙腈的组成比例小于50%时，细辛脂素的保留时间过长、甚至无法被洗脱；当纯乙腈的组成比例大于50%时，流动相的洗脱强度较大，导致甲基丁香酚峰与溶剂峰共洗脱，细辛脂素与杂质干扰物的分离度下降，方法的定量准确度受到影响；只有在纯乙腈的组成比例为50%时，甲基丁香酚与溶剂峰、细辛脂素与杂质干扰物的分离度均达到基线分离，且分析时间较短，两者的峰形对称。因此最终确定“纯乙腈-纯水(5∶5, v/v)”为研究的流动相。

研究建立了高效液相色谱方法同时测定柴辛注射液中甲基丁香酚、细辛脂素含量的方法，方法的准确度RSD小于1%、精密度RSD值小于0.3%，平均回收率在88%以上，被测样品溶液放置48 h后含量RSD仍小于0.6%，准确度高、峰形佳、色谱方法简单、操作性极强。上述表明本方法适应于检测柴辛注射液中的有效组分的含量。

试验已经对3～5家的柴辛注射液产品进行了分析检测，但仍需收集更多的同类产品，用于扩大方法的适用范围，以最优化现有方法。

4 结 论

研究选择甲基丁香酚、细辛脂素作为研究对象，建立了高效液相色谱法同时测定柴辛注射液中两种有效成分的方法，方法操作简单，准确性、精密度高，可以适用于其质量控制，可为后续标准的完善和产品疗效的研究提供科学依据。