一起羊皮肤脓肿病例的病原诊断及其防治

李永光,简莹娜,贺胜,李秀萍,胡勇,王戈平,王光华,林伟山,马利青

(1.青海省民和县畜牧兽医站,民和 810800；2.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

近年来，国家加大对畜牧业发展的扶持力度，畜牧养殖业也取得了更好更快的发展，其中从事羊养殖的农户逐渐增多，羊养殖的规模也越来越大。皮下脓肿成为羊常见的疾病之一，不但影响羊只的生长、影响羊毛和羊皮质量，降低畜产品品质，甚至造成死亡，给养殖户带来巨大的经济损失。羊肉制品中有脓包，直接影响肉质品质，并且有潜在的食品安全隐患。

羊皮下脓肿病存在于几乎所有养羊的国家或地区，是国际公认的难以防治的传染病之一。皮下脓肿病是由化脓病菌通过感染羊受损的皮肤或黏膜所引起的一种羊传染性疾病。病畜通过长期排脓，导致病原随着排出的脓汁在羊群中进行传播，影响羊只的生长发育以及羊产品的质量，进而对羊养殖业造成巨大的经济损失。该病普遍存在于养羊业中，其主要原因可能与病原种类较多有关，已知伪结核棒状杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌等病原菌能导致山羊感染发病。

肖芳萍等[1]认为羊的疥螨病、羊痘、羊口疮、羊伪结核病，都发生于羊的体表皮肤，认为以上病原为诱发皮下脓肿的重要致病原。

陈玉祥、万一元等[2，3]认为，干酪样淋巴结炎以及皮肤脓肿其主要病原为人畜共患的伪结核棒状杆菌感染所引起的一种接触性、慢性传染病，特征为局部淋巴结发生干酪样坏死，病羊脓汁污染的饮水、饲料等是重要的传染媒介，其次有松鼠葡萄球菌及链球菌、四联球菌等。伪结核棒状杆菌可引起多种动物感染，主要有羊干酪性淋巴结炎、骆驼脓肿、马溃疡性淋巴结炎、兔化脓性感染和人的化脓性淋巴管炎。自然发病中，羊发病率较高，常在30%以上[4]。感染发生于破损皮肤，也可通过摄食污染的饲料引起。动物感染无特征性临床表现，主要有体温升高，食欲减退，精神差，生产性能下降，皮下及淋巴结出现化脓性病变，呈脓性干酪样坏死，有的病菌侵入体内，在肝、脾、肺、子宫角、肠系膜等处发生大小不等的结节，内含黄白色的脓性干酪样物质。严重的患病孕畜产出死胎、畸胎，严重者甚至引起病羊死亡[5]。由于该病发生缓慢，临床症状不明显，常被人们忽视，但它却是世界上公认的难以治愈的传染病之一，一旦侵入畜群，很难彻底根除，给养殖业造成极大的经济损失。近年来，有文献报道关于羊皮下脓肿病，其致病菌主要为伪结核棒状杆菌和金黄色葡萄球菌两种[6]。

化脓隐秘杆菌，于1893 年首次发现，原称化脓棒状杆菌，1997 年 Pascual Ramos等将该菌从放线菌属中重新分类为隐秘杆菌属，化脓隐秘杆菌在隐秘杆菌属中致病性最强，是一种条件性致病菌，化脓隐秘杆菌不仅感染牛羊猪等经济类动物，同时也会感染猫、狗、兔、狐狸、猴、鹅和鸭等其他动物[7]。李章程等[8]在山羊皮下脓肿病料采集中分离出化脓隐秘杆菌。

本论文研究目的在于检测并分离该合作社羊皮肤脓肿病原，对病原菌进行鉴定、致病性研究以及耐药性试验，提出合理的预防、治疗方案，减少该合作社的养殖损失。

1 试验方法

1.1 发病情况

民和县某合作社养殖品种为湖羊，为网床全舍饲养殖，主要饲草料为青贮和当地产牧草，精饲料自配(主要成分为玉米、麸皮和麻渣)，预混料为外购。现饲养 215 只湖羊，发病羊只 11 只，在颈部、头部、或在四肢处有皮下脓肿，其中 4 只病羊患处已开始变硬吸收，另外 7 只患病羊患部脓包处质地软，并发烫。

1.2 样品采集及病原菌分离

无菌采集了 7 只羊的皮下脓肿内容物，简述之：患部剃毛，先用碘酒棉球消毒，再用酒精棉球脱碘，再用 5 mL 注射器 16#针头刺破脓包，缓缓吸出皮下脓肿内容物，至病料采集箱冷藏保存，及时送至实验室检验进行细菌分离培养。

1.3 致病性研究

取该分离菌株接种至普通肉汤，经37 ℃培养18 h，取培养物，注射昆明系小鼠，设置实验组2组以及对照组，每组2只，其中：实验组 Ⅰ，对每只实验小鼠腹腔注射分离菌18 h培养物0.5 mL；实验组 Ⅱ 每只实验小鼠腹腔注射 0.2 mL；对照组腹腔注射营养肉汤培养基，每只0.5 mL。

1.4 分子生物学诊断

将分离细菌利用细菌基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，利用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增，并切胶纯化将其送至金唯智生物有限公司进行测序。

1.5 药物敏感性试验

本试验对分离菌株利用K-B扩散法进行药敏试验。

2 结果

2.1 病原分离

将7份无菌采集的患羊皮下脓肿内容物送检至实验室，经组织涂片染色，脓肿内容物中检测到疑似球菌，在组织涂片中的细菌形态详见图1。同时，接种至普通肉汤、厌气肉肝汤和鲜血鞋面培养基上，进行可疑菌的分离培养，经37 ℃条件下培养24 h，在鲜血平板培养基上，生长出中等大小、具有典型β溶血环的乳白色菌落，36 h后变为金黄色菌落，经革兰氏染色，该分离菌株为革兰氏阳性球菌，其形态与组织片中检测细菌一致，其形态详见图2。

图1 脓肿内容物组织瑞特氏染色

图 2 分离细菌革兰氏染色形态

2.2 致病性研究

经试验发现：实验组 Ⅰ 于注射后24 h死亡1只，48 h内死亡1只；实验组 Ⅱ 在注射后60 h左右死亡1只；对照组96 h内未发现任何异常；并且在致死实验小鼠的肝脏中分离得到该菌，说明该菌株具有一定的致病性。

2.3 分子生物学试验

经PCR鉴定到目的片段，结果见图3，测序结果进行在线“BLAST”比对，鉴定该菌株为金黄色葡萄球菌。

图3 细菌16S rRNA PCR检测结果图(M：DL2000；1：分离菌株样品DNA)

2.4 药物敏感试验

药物敏感性试验结果显示：该菌株对新生霉素(NV)、阿莫西林(AMC)、头孢噻吩(KF)、阿米卡星(AK)、头孢唑林(KZ)、氨苄西林(AMP)、克林霉素(DA)、头孢吡亏(FEP)、氧氟沙星(OFX)、阿奇霉素(AZM)、庆大霉素(CN)等敏感，而对环丙沙星(CIP)、多粘菌素(PB)耐药，结果详见表1。

表1 分离菌株(金黄色葡萄球菌)的药敏试验结果

3 结论

经染色镜检、病原菌的分离培养、PCR检测、致病性试验以及药物敏感研究，从患病羊只脓汁处分离培养到致病性金黄色葡萄球菌，该菌对于检测的大多数药物均敏感，而对环丙沙星(CIP)及多粘菌素(PB)耐药。

4 讨论

对该合作社进行样品采集并调研时观察发现其网床多处有尖锐的铁丝、钢管接头、劈开的漏粪地板竹板等，所以该养殖场羊只患皮肤脓肿疾病与养殖环境造成羊只创伤有直接关系。一般病原菌存在于环境中，可通过损伤的皮肤、污染的剪毛工具、断尾器械或药浴传播，并发生皮肤感染。如不恰当的药浴、剪毛，羊圈中的钉子、铁丝尖头没有清理均易造成病菌的传播。病理性损伤引起患羊的皮肤增厚、脓肿、有干酪样渗出物，脓汁流出与毛纤维混合，在被毛形成毡硬痂。部分患病羊感染病原菌后可取道于淋巴源性和血源性扩散，引起各内脏器官的转移性脓肿，常见于关节腔和脏器脓肿。

从本研究分离培养结果来看，只分离得到了金黄色葡萄球菌，该菌对于检测的大多数药物均敏感，而对环丙沙星及多粘菌素耐药，也能反映出该养殖合作社抗生素使用相对规范，该菌株没有出现高度耐药情况。

但经文献报道，学者们还分离得到多种病原，葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、化脓性隐秘杆菌、坏死梭杆菌、羊传染性脓疱病毒及羊痘病毒等[3,8-11]。因此，多种病原菌及病毒的存在，给防治该病带来一定的麻烦和不可预见性。对于养殖中出现皮肤脓肿疾病，建议对其致病细菌或病毒进行及时地检测，利用敏感抗生素治疗或者疫苗进行免疫，切不可乱用抗生素以避免抗生素残留以及耐药菌株的产生。