高原型藏羊多胎性能选育及生长发育分析

马世科，孙芸，周玉青，孙武，马玉红

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016；2.海北藏族自治州农牧科学研究所，海北 812200；3.海北藏族自治州高原生态畜牧业科技示范园管委会，海北 812200)

藏羊是青藏高原最具代表性绵羊品种。在自然放牧条件下，繁殖性能较低，一般为一年一胎，一胎一羔，双羔极少。因此，学术界认为藏羊为单胎绵羊品种。对海北藏族自治州高原型藏羊多胎情况调查发现，在111户饲养户中52.52%群体存在产多胎情况，数量占调查母羊总数的0.90%[1]。FecB基因是科学家最早发现与绵羊繁殖力有关的基因。近年来，人们一直试图通过分子遗传标记技术来培育具有高繁殖力的绵羊后代。经研究发现，在我国的策勒黑羊、多浪羊、小尾寒羊、杜寒杂交肉羊以及洼地绵羊等羊群中都存在FecB 基因，且FecB基因可能是这些绵羊具有多胎性状的主效基因[2]。研究团队在完成高原型藏羊多胎性能调查基础上，对特定群体开展基因检测，首次发现藏羊群体中存在携带有FecB基因个体，因此，组建多胎藏羊群开展跟踪研究和定向选育。现将前期研究结果汇总如下：

1 材料与方法

1.1 血液样品采集

血样采用 EDTA-K2抗凝采血管静脉采血2 mL，于-20 ℃冷冻保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

血液基因组DNA纯化试剂盒、基因分型试剂盒Light Cycler 480 High Resolution Melting Master购自罗氏公司，实时荧光定量PCR仪为罗氏公司Light Cycler 480 II。

1.3 引物设计与合成

为检测该突变，采用primer 6.0 软件设计BMPR-1B基因外显子6部分序列克隆及HRM检测引物(BMPR-1B基因登录号：NC_040257)，引物信息见表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 引物

1.4 BMPR-1B片段扩增与FecB基因鉴定

以基因组DNA为模板，扩增不同检测位点的PCR片段，反应体系为25 μl。PCR反应体系：DNA Template 2 μl， Primer F(10 μM) 1 μl，Primer R(10 μM) 1 μl，Premix Taq 12.5 μl，ddH2O 补至25 μl。PCR反应循环的设置：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性30 sec 60 ℃复性30 sec，72 ℃延伸1 min，40个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反应结束后取5 μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。将检测条带单一的样品送往北京擎科新业生物技术有限公司进行测序分析。

1.5 HRM检测体系

以多胎藏羊选育群中的母代与子代羊群为检测对象，以构建好的FecB基因HRM检测体系为标准对羊群所有个体进行FecB基因分型。HRM反应体系为10 μL：High Resolution Melting Master 5 μL，MgCl2(25 mmol/μL)1.2 μL，FecB_H正反引物各0.1 μL，模板DNA(20 ng/μL)0.5 μL，ddH2O为3.1 μL。反应程序如下：首先95 ℃预变性10 min；随后扩增45个循环，每个循环温度依次为94 ℃保持15 s，退火温度62 ℃保持30 s；扩增结束后进行HRM分型，分型条件为：95 ℃保持1 min，40 ℃保持1 min，65 ℃保持1 s；从65 ℃开始按25 次/℃的频率收集荧光信号；最后降温至40 ℃保持40 s。检测结果用自带Gene Scanning软件进行数据分析。

1.6 生长性能测定

选择海北州高原生态畜牧业科技示范园多胎藏羊群所产羔羊为测定对象，多胎和单胎羔羊分别在初生和6月龄测定体重。

2 试验结果

2.1 多胎繁殖母羊FecB突变基因多态性检测结果

从多胎母羊分布群中，采集多胎母羊血样41份，单羔母羊血样60份。在多胎组中检出GA型杂合子个体13 只，占31.71%；AA型28只，占68.29%；对照组检出GA型1只，占1.67%；AA型59只，占98.33%。试验组GA型杂合子比例显著高于对照组，基因检测结果见表2。

表2 多胎繁殖母羊FecB突变基因多态性检测结果

2.2 FecB基因在大群体中的筛查

在海北州四县高原型藏羊群中随机抽取3 880只羊的血样进行基因检测，结果显示仅有0.49%个体存在FecB突变个体，其中：祁连县群体中FecB突变个体比例最高为2.04%，刚察县群体中没有检测到FecB突变个体。检测到个体均为杂合子(GA)，其余为野生型(AA)，测定结果见表3。

表3 海北四县FecB基因筛查情况统计表

2.3 多胎藏羊定向选育结果

在只有杂合子母羊、缺乏纯合子和杂合子种公羊情况下，从2014年开始组建多胎母羊群，与普通种公羊选配，从多胎后代中检测多胎基因，选留杂合子(GA)种公羊，然后利用杂合子(GA)种公羊与杂合子(GA)母羊选配，培育纯合子(GG)种公羊。经过持续定向培育，现已培育出纯合子和杂合子种羊。2021年，对海北州高原生态畜牧业科技示范园、祁连县种羊场2 个先期建立多胎群所产538只羔羊进行基因鉴定，含FecB基因个体比例已达53.16%，其中纯合子比例达到10.59%，杂合子比例达到42.57%，当年羔羊基因检测结果见表4。

表4 多胎群羔羊基因检测结果

2.4 不同FecB基因型母羊多胎率

目前培育纯合子母本数量少，尚未进入繁殖年龄，本次统计只涉及多胎群杂合子和野生型。连续三次产羔记录显示，AG型母本其多胎概率平均为45.79%；AA野生型，其多胎的概率为25.00%。对两组数据进行独立样本T检验得出，AG型母本产多胎率显著(P<0.05)高于AA型母本。多胎群不同基因型藏羊连续三胎多胎率统计结果见表5。

表5 不同FecB基因型母本连续三产多胎率统计表

2.5 多胎羔羊生长发育

对多胎和单胎羔羊体重进行跟踪测定，多胎羔羊的初生重平均3.14±0.60 kg，单胎为4.24±0.62 kg，进行独立样本T检验，二者差异极显著(P<0.01)；多胎羔羊6月龄体重28.11±2.48 kg，单胎28.35±3.78 kg，二者差异不显著(P>0.05)。羔羊初生和六月龄体重测定见表6。

表6 羔羊体重统计表

3 结果与讨论

3.1绵羊多胎性能是目前国内外研究热点，前期团队在完成调查和基因检测基础上，开始组建多胎群进行跟踪研究，研究并证实藏羊群体中存在与多胎性能相关的FecB基因，且 FecB基因对藏羊多胎性能存在显著影响，但高原型藏羊多胎性能分子遗传机理尚不明晰，FecB基因多胎表型分类界定仍需要细化，藏羊多胎性能可能还存在其它多基因互作，相关机制仍需要进一步探究。

3.2随着多胎性状越来越被人们熟知，具有多胎高产性状的绵、山羊在外界环境影响的基础上，被人们有目的的选育，逐步产生了具有稳定性状的品种，但羊的繁殖性状作为数量遗传性状，其遗传力较低，仅有0.1 左右，采用常规育种手段十分困难[3]。团队前期在仅有杂合子母羊情况下，通过单基因分子选择，开展多胎定向选育，培育纯合子虽未进入产羔阶段，但杂合子双羔率最高达58.82%，同时发现藏羊多胎性能不仅与内在基因相关，而且与饲养管理等外部环境重要相关。团队在完成育种前端主要试验研究后，在开展定向培育的同时，将开展多胎藏羊饲养管理方面配套技术研究。多胎型藏羊培育对提升我省在藏羊种业上的创新水平、培育符合现代羊产业发展趋势良种具有重大意义。

3.3自然放牧条件下，多胎母羊摄入营养难以满足多胎生产需要，常出现羔羊初生重低、死亡率高和生长发育缓慢等现象。本试验研究表明，在同等放牧补饲管理条件下，多胎羔羊初生重虽低于单胎羔羊的初生重，但后期生长发育迅速；6月龄时，体重已与单胎羔羊体重无异，更不会对后期生产性能造成影响，因此，饲养多胎藏羊需加强饲养管理和相关配套方面投入。