冠心病患者外周血单核细胞亚群分布及其TLR4 表达水平研究*

徐 斌，高 枫，陈 浩，钟 玲，吴禹宏，苏 伟

（无锡市中医医院心血管内科，江苏 214071）

冠心病（coronary artery heart disease，CHD）是导致人类死亡的主要原因之一，冠状动脉粥样硬化斑块形成和破裂是冠心病的主要病理基础[1]。炎症反应是导致粥样斑块失稳的主要因素，在冠心病发生和发展中起着关键作用[2]。循环单核细胞参与斑块失稳的主要过程，包括斑块炎症反应和基质降解[3]。人类外周血单核细胞分为经典型（CD14++CD16-，classical monocytes，CM）、中间型（CD4++CD16+，intermediate monocytes，IM）和非经典型（CD4+CD16++，nonclassical monocytes，NCM），其中IM 与炎症反应关系最为密切。Toll 样受体 4（Toll-like receptors 4，TLR4）是外源性脂多糖和内源性热休克蛋白的受体，在先天免疫和炎症反应中具有重要作用。研究表明，TLR4 参与冠心病斑块形成和失稳的各个阶段[4]。本研究选取2020 年 10 月—2021 年 3 月于我科住院的 28 例稳定型心绞痛（SA 组）和32 例急性冠脉综合征（ACS组）初诊患者，通过检测不同分型CHD 患者外周血单核细胞亚群分布及各单核细胞亚群表面TLR4 的表达，探讨两者在冠心病易损斑块发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取首次诊断的稳定型心绞痛患者28 例为SA 组，急性冠脉综合征患者32 例为ACS 组。纳入标准：（1）符合《急性冠脉综合征急诊快速诊治指南（2019）》[5]及《稳定性冠心病诊断与治疗指南》[6]相关诊断标准，经冠脉造影或冠脉CT 血管成像证实；（2）年龄 18～85 岁；（3）未服用阿司匹林或他汀类药物。排除标准：（1）急性感染、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、严重肝肾疾病；（2）近2 周内有手术或外伤史。另选取我院体检中心健康体检者30 例为对照组。本研究经我院伦理委员会批准，入选对象均签订知情同意书。三组性别、年龄、体质量指数（BMI）、吸烟、饮酒、合并高血压病、糖尿病、冠心病家族史、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 三组一般资料比较 ［，例（%）］

表1 三组一般资料比较 ［，例（%）］

指标 对照组（n＝30） SA 组（n＝28） ACS 组（n＝32） 统计值 P 值年龄（岁） 66.67±5.72 70.07±8.77 67.32±10.13 1.329 0.270性别（男/女） 19/11 18/10 19/13 0.177 0.915吸烟 11（36.67） 7（25.00） 12（37.50） 1.275 0.529饮酒 6（20.00） 2（7.143） 6（18.75） 2.208 0.331高血压病 22（73.33） 23（82.14） 23（71.88） 0.973 0.615糖尿病 15（50.00） 14（50.00） 10（31.25） 2.952 0.228冠心病家族史 8（26.67） 8（28.57） 6（18.75） 0.900 0.638 BMI（kg/m2）24.98±2.6225.35±2.4425.19±2.310.1690.845 TC（mmol/L） 4.44±1.14 4.16±1.08 4.22±1.24 0.472 0.625 LDL-C（mmol/L） 2.56±0.74 2.33±0.73 2.42±0.92 0.614 0.554

1.2 检测方法

1.2.1 主要试剂和仪器：藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人TLR4 抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD16 抗体、别藻青蛋白（APC）标记的鼠抗人CD14 抗体（美国 BD 公司），FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司），7700 生化分析仪及配套血脂试剂（德国Beckman 公司）。

1.2.2 流式细胞仪检测：采集入选对象清晨空腹肘静脉血，肝素钠抗凝，取100 μL 至流式管中，分别加入PE 标记鼠抗人TLR4 抗体、FITC 标记鼠抗人CD16 抗体、APC 标记鼠抗人CD14 抗体。涡旋震荡混匀，室温下孵育15 min，然后与500 μL 红细胞裂解液混匀，温育10 min，离心后弃上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤并重悬，终体积为500 μL。在流式细胞仪上检测 CD14++CD16-、CD14++CD16+、CD14+CD16+单核细胞亚群占比以及TLR4 在不同单核细胞亚群的表达水平。

1.3 统计学处理 应用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布及方差齐性的计量数据以中位数和四分位数[M（P25～P75）]表示，组间比较采用 Kruskal-Wallis 检验；计数资料以频数和率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

三组IM 占比及TLR4 在IM 细胞的表达比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），ACS 组 IM 占比及TLR4 在 IM 细胞的表达高于对照组（χ2＝-3.975，P＝0.000；χ2＝2.284，P＝0.022）和 SA 组（χ2＝-3.133，P＝0.005；χ2＝2.214，P＝0.032），差异均有统计学意义；而SA 组与对照组 IM 占比（χ2＝0.768，P＝0.452）及 TLR4在 IM 细胞的表达（χ2＝0.112，P＝0.911）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。三组NCM 占比及TLR4 在NCM 细胞的表达比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），对照组 NCM 占比较 ACS 组（χ2＝2.012，P＝0.043）及 SA 组（χ2＝2.397，P＝0.017）高，而 TLR4 在NCM 细胞的表达低于 ACS 组（χ2＝-3.154，P＝0.000）和 SA 组（χ2＝-2.445，P＝0.014），差异均有统计学意义；而 SA 组与 ACS 组 NCM 占比（χ2＝0.234，P＝0.815）及 TLR4 在 NCM 细胞的表达（χ2＝1.198，P＝0.231）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。三组CM 占比及TLR4 在CM 细胞的表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

表2 三组单核细胞亚群分布及TLR4 表达比较 （%）

3 讨 论

人类单核细胞来源于骨髓造血干细胞，可分化为巨噬细胞和树突状细胞，控制先天性和适应性免疫反应。单核细胞具有高度异质性和可塑性，基于CD14（脂多糖相关受体）和 CD16（FcγⅢ受体）的相对表达分成CM、IM 和NCM 亚群，分别占循环单核细胞的80%～95%，2%～8%和2%～11%。三类亚群细胞的功能不同，CM 具有强大吞噬能力，是重要的清道夫细胞[7]；IM 的功能包括产生活性氧（ROS）、抗原呈递、参与T 细胞增殖和刺激炎症反应[8]；NCM 具有巡逻特性，可能参与免疫监视过程，一旦有血管炎症或受损的迹象能迅速迁移到相应部位[9]。

越来越多的研究表明，循环单核细胞在动脉粥样硬化的发生和发展中起着重要作用[10]。有横断面研究表明，单核细胞计数可独立预测心血管事件的发生[11]。单核细胞亚群分布不平衡可能与冠状动脉粥样斑块不稳定及心血管事件发生有关。有研究发现，CD14+CD16+单核细胞（即 IM 和NCM）相对增加与冠心病患者冠脉CTA 评估的冠状动脉斑块易损性有关[12]。本研究结果显示，ACS 组IM 占比高于SA组和对照组，差异均有统计学意义，表明IM 细胞占比上调可能与ACS 斑块不稳定性有关，与OZAKI等[13]研究结果类似。对照组NCM 占比高于ACS 组和SA 组，表明NCM 细胞可能有抗动脉粥样硬化作用。NCM 细胞在血管内和组织中广泛存在，产生低水平的CD14 和促炎细胞因子以及高水平抗炎因子。研究表明，NCM 细胞可以在动脉粥样硬化性疾病中修复血管内膜，去除血液中脂质，一定程度上具有稳定斑块的作用[9，14]。

TLR4 是脂多糖（LPS）的信号受体，与热休克蛋白、纤维蛋白原和最小修饰低密度脂蛋白也有相互作用[15]。有研究表明，TLR4 可以活化参与动脉粥样硬化形成的单核细胞[16-17]。本研究结果显示，ACS 组TLR4 在IM 的表达高于SA 组和对照组，提示IM 细胞引起斑块不稳定可能与TLR4 高表达有关。对照组TLR4 在NCM 的表达低于SA 组和ACS 组，表明TLR4 低表达可能是NCM 抗炎、抗动脉粥样硬化的因素之一。

综上所述，IM 细胞亚群可能与冠心病患者斑块不稳定有关，TLR4 高表达可能是IM 细胞活化原因之一。NCM 细胞亚群可能具有抗动脉粥样硬化作用，可能与其TLR4 低表达有关。调控单核细胞亚群分布及其TLR4 表达或是未来冠心病的治疗方向之一。