Notch 信号通路在骨性关节炎软骨干细胞迁移及分化中的作用*

乔天华 ，邹丰锴 ，孙魏巍 ，陈民浩 ，王友华 ，徐 华

（1 南通大学附属医院骨科，江苏 226001；2 大连医科大学）

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨退化、关节间隙狭窄及骨赘形成为主要特征的关节退行性疾病，目前OA 发病率逐年升高，给患者及社会造成极大的经济负担[1-2]。临床上治疗OA 药物仅在一定程度上改善患者症状，延缓病情进展，但不能根治，后期关节变形只能借助手术治疗，但人工关节假体存在假体寿命有限、费用较高等问题。OA 发生的细胞和分子机制尚未完全清楚，近年来发现软骨组织中存在软骨干细胞（cartilage-derived stem/progenitor cells，CSPCs），具有强大的分化潜能、自我更新、表面抗原表达及迁移能力[3-5]。CSPCs 对软骨微环境稳态的维持及修复具有重要作用，可产生更多的转化生长因子（TGF）、骨形态生长蛋白（BMP）等保护因子稳定软骨细胞外基质，防止软骨丢失和破坏。此外，CSPCs 还可抑制基质金属蛋白酶（MMP）及炎症因子的表达[6-8]。YU 等[9]利用 CSPCs 作为种子细胞，成功修复了牛股骨头全层软骨缺损，修复后的软骨组织机械性能接近于正常软骨组织。本研究以大鼠CSPCs 为研究对象，观察炎症环境下CSPCs 迁移及分化能力的改变，研究Notch 信号通路对CSPCs 的调控作用及机制，为OA 的防治提供理论基础和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 大鼠CSPCs 提取 选择5 日龄SD 大鼠（购自南通大学实验动物中心），无菌条件下取出大鼠膝关节软骨，置于含青、链霉素的PBS 中反复冲洗3 次。于恒温摇床上胰酶消化15 min 后终止消化，PBS 冲洗3 次，加入Ⅱ型胶原酶消化6～8 h。筛网过滤后离心重悬，以1×106个细胞/孔接种于铺有纤连蛋白的6 孔板内，18 min 后吸去上清，加入完全培养基，待细胞长至80%～90%融合后传代，收集4～6 代细胞进行后续实验。

1.2 CSPCs 处理 将 CSPCs 以 5×104个/孔接种于 6孔板中，37 ℃、5%CO2培养，待细胞长至 70%～80%融合后，向培养基中分别加入IL-1β（10 ng/mL）、DAPT（1.5 μmol/L）、VPA（11 mmol/L）进行干预，提取RNA 进行后续实验。

1.3 细胞划痕实验 将CSPCs 接种于6 孔板中，5×106个细胞/孔，37 ℃、5%CO2培养，待细胞密度80%～90%时用无菌枪头垂直于6 孔板长轴进行划痕，PBS 冲洗。加入无血清基础培养基，分别加入IL-1β、IL-1β+DAPT、VPA 进行干预，于 0、6、12、24 h 后观察并拍照。

1.4 荧光定量PCR 检测相关基因表达 采用RNA快速提取试剂盒提取CSPCs 总RNA，用逆转录试剂盒获得cDNA。RT-PCR 反应体系：cDNA 混合液2 μL，上下游引物各 1 μL，SYBR Green 10 μL，DEPC水6 μL，检测成软骨相关基因SOX 9、COL2A 1 及Notch 通路相关基因表达，GAPDH 为内参基因。各引物序列见表1。

表1 各引物碱基序列

1.5 统计学处理 应用GraphPad Prism 8 统计学软件进行数据分析及处理。计量资料以表示，组间比较采用t 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 炎症环境抑制CSPCs 迁移能力 利用IL-1β体外刺激CSPCs 模拟OA 炎症环境，刺激24 小时后，CSPCs 向划痕区的移动速度明显下降，提示其迁移能力的减弱（图1）。

图1 划痕实验显示IL-1β 对CSPCs 迁移能力的抑制作用

2.2 炎症环境抑制CSPCs 成软骨分化能力 IL-1β刺激CSPCs 后，成软骨相关基因COL2A 1 及SOX 9的表达在 IL-1β 刺激 36 小时后明显下降（P＜0.05），提示炎症环境下CSPCs 成软骨分化能力减弱（图2）。

图2 RT-PCR 显示 IL-1β 对CSPCs 成软骨分化能力的抑制作用

2.3 炎症环境导致 CSPCs 内 Notch 信号通路激活 IL-1β 刺激 CSPCs 后，Notch 信号通路中的受体Notch 1、配体Jagged 1 以及下游分子HES 1 的表达均显著上升（P＜0.05），表达趋势与Notch 通路激活剂VPA 刺激后的细胞一致，提示炎症环境下CSPCs内Notch 信号通路激活（图3）。

图3 RT-PCR 显示炎症环境下Notch 信号通路相关基因的表达升高

2.4 Notch 信号通路对CSPCs 迁移能力的影响 利用VPA 在正常CSPCs 中激活Notch 信号通路，细胞迁移能力明显下降。而在炎症环境下加入Notch 通路抑制剂DAPT，12 h 后迁移至划痕区域的CSPCs 较IL-1β 组以及VPA 组明显增多，迁移能力明显增强，提示Notch 信号通路的激活与炎症环境下CSPCs 迁移能力的减弱密切相关（图4）。

图4 划痕实验显示Notch 信号通路对CSPCs 迁移能力的抑制作用

2.5 Notch 信号通路对CSPCs 成软骨分化能力的影响 VPA 刺激正常CSPCs 后，成软骨分化相关基因COL2A 1 及SOX 9 的表达明显下降。利用DAPT 阻断 Notch 信号通路后，COL2A 1 及 SOX 9 基因的表达较 IL-1β 组增加（P＜0.05），提示 Notch 信号通路与CSPCs 成软骨分化能力密切相关（图5）。

图5 RT-PCR 显示Notch 信号通路对CSPCs 成软骨分化相关基因表达的影响

3 讨 论

关节内软骨损伤是骨关节炎主要病理表现，由于软骨修复能力有限，传统药物很难取得满意疗效，损伤软骨的修复仍是临床面临的一大挑战。近年来，以干细胞为基础的软骨损伤修复策略越来越受到重视，利用内源性CSPCs 促进OA 软骨修复似乎是一个理想途径。本研究通过体外模拟OA 炎症微环境，发现CSPCs 的迁移能力及成软骨分化能力均明显减弱。推测OA 软骨出现损伤后，由于炎症环境的影响，CSPCs 不能及时迁移到损伤部位，同时CSPCs 成软骨分化能力下降，导致软骨自身修复能力减弱，从而促进OA 的发生和发展。

Notch 信号分子在各类组织中广泛表达，在细胞增殖、分化和迁移中扮演重要角色，包括调节多种组织干细胞的自我更新和分化方向[10]。Notch 通路主要由表达于相邻细胞上的Notch 受体和配体，以及表达于细胞内的转录因子、下游分子和其他调节分子组成。哺乳动物Notch 受体有4 种，分别为Notch 1～4，配体有 5 种，分别为 DLL（Delta-like）1、3、4 和Jagged l，Notch 信号的下游分子主要为bHLH 家族转录因子，包括 HES（hairy/enhancer of split）和HESR（HES-related）家族分子。本研究发现，炎症环境下CSPCs Notch 受体/配体及其下游分子HES 1表达均上升，表明Notch 信号通路被激活。多项研究证实，Notch 信号通路在干/祖细胞与成熟细胞间具有表达差异[11-12]。阻断Notch 信号能降低干细胞特征，促进干细胞分化[13]，推测Notch 信号在干细胞自我更新和定向分化间存在调节平衡点[14]。Notch 信号通路维持神经干细胞（neural stem cells，NSCs）自我更新[15]，抑制分化为胶质细胞[16]，促进分化为神经元[17]。阻断Notch 信号可促进脂肪干细胞早期分化为脂肪细胞[18]。目前关于Notch 信号是否参与调控CSPCs 功能尚无有效研究，探索Notch 信号通路影响CSPCs 的细胞分子机制，对研发CSPCs 治疗OA具有重要意义。本研究发现抑制Notch 信号通路后，CSPCs 在炎症环境下的迁移能力和成软骨分化能力明显恢复，提示Notch 信号通路可能是骨关节炎中CSPCs 功能的重要调节因素。

综上所述，本研究结果表明OA 炎症环境下CSPCs 迁移和成软骨分化能力显著降低，此过程与Notch 信号通路的异常激活密切相关，抑制该通路后可明显改善CSPCs 的迁移和成软骨分化能力。