血清α-突触核蛋白及自噬相关蛋白与帕金森病相关性研究*

严佳男，张海影，姜勇成，顾晓苏

（南通大学附属医院神经内科，江苏 226001）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是常见的中枢神经系统退行性疾病[1]，目前全世界65 岁及以上人群患病率为1%[2]，而中国约有1 700 万例患者，随着人口老龄化的加剧，由PD 带来的社会问题和社会负担日益增加[3]。PD 主要病理特点为黑质和纹状体区域多巴胺能神经元的丢失以及含有突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）的路易小体（Lewy bodies，LBs）的形成[4-5]。α-syn 过度表达和聚集形成的寡聚体或聚集体对神经元具有毒性作用，是导致多巴胺能神经元死亡的重要因素[6]。越来越多的证据表明，内质网应激、自噬功能障碍和线粒体功能障碍可能参与PD 发病机制[7-10]。本研究选择 2019 年 9 月—2020 年9 月于我科门诊就诊的38 例PD 患者，分析血清自噬相关蛋白LC3B、p62 及α-syn 表达水平及其与PD 严重程度的相关性，以期为阐明PD 发病机制和治疗靶点提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 PD 患者 38 例（PD 组），其中男性21 例，女性 17 例，年龄 44～81 岁,平均 66.05±9.13岁。选取我院同期健康体检者38 例作为对照组，其中男性19 例，女性19 例，年龄48～80 岁，平均64.97±8.94 岁。两组性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。PD 组纳入标准：（1）符合国际运动障碍协会（MDS）2015 年 PD 临床诊断标准，且行头颅CT 或MRI 检查；（2）患者或其法定代表人同意参加本研究，签署知情同意书。排除标准：（1）遗传变性性帕金森综合征、继发性帕金森综合征、帕金森叠加综合征、特发性震颤等患者；（2）全身严重系统性疾病患者；（3）精神疾病患者。根据Hoehn-Yahr 分级标准将 PD 患者进一步分为早期组（1～2.5 级）24 例和中晚期组（3～5 级）14 例。

1.2 检测方法 采集受试者晨间空腹静脉血，4 ℃，3 000 r/min 离心10 min，取上清置于-80 ℃待检。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清α-syn 水平。将标准品和血清样本加到包被有α-syn 抗体的96孔板，温育，洗去未结合的游离成分，加入α-syn 多抗，温育、洗涤后再加入显色剂A、B，尽快加入终止液。在Thermo 酶标仪于450 nm 波长处测定吸光度（OD），以标准品浓度作为横坐标，OD 值作为纵坐标，以双对数拟合，在标准曲线上查出血清样本αsyn 浓度。血清 LC3B、p62 水平检测同总 α-syn。

1.3 统计学处理 应用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较采用独立样本t 检验；计数资料以频数表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PD 早期组与中晚期组一般资料比较 PD 中晚期组年龄、发病年龄及病程大于早期组，差异均有统计学意义（P＜0.01），而两组性别差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

表1 PD 早期组与中晚期组一般资料比较

2.2 各组血清 α-syn、LC3B、p62 水平比较 PD 组血清α-syn、LC3B 水平高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），而 PD 组血清 p62 水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。PD 中晚期组血清α-syn、LC3B 水平高于早期组，差异均有统计学意义（P＜0.05），中晚期组血清 p62 水平与早期组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 PD 组与对照组血清 α-syn、LC3B、p62 水平比较

表3 PD 早期组与中晚期组血清α-syn、LC3B、p62 水平比较

3 讨 论

自噬是所有真核生物高度保守的细胞降解和循环过程，细胞膜包裹部分胞质和需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，后者在溶酶体的作用下降解，从而维持内环境和神经元的稳态[11]。神经元由于有丝分裂后的特性，极易受缺陷细胞器和异常蛋白质积累的影响，因此自噬对于维持神经元的稳态至关重要。在生理情况下，自噬一般维持在较低水平，当出现氧化损伤、蛋白质聚集、细胞器损伤等细胞损害时，自噬水平迅速上调[12]。越来越多的证据表明，自噬失调与阿尔兹海默症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病等神经退行性疾病的发病机制密切相关[13-14]。

研究发现，6-DHDA 损伤的SH-SY5Y[15]细胞中Park7 的表达上调，LC3B-Ⅱ水平也显著升高，自噬激活。本研究分析PD 患者及健康对照者血清自噬相关蛋白LC3B、p62 的表达，显示PD 组血清LC3B水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明可能由于自噬过度激活导致帕金森病的发生进展。而两组血清p62 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），这可能与样本量过少有关。PD 中晚期组血清α-syn、LC3B 水平较早期组升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示随着帕金森病病程进展，血清αsyn、LC3B 水平升高。有研究指出，急性脑梗死患者脑脊液及血清中Beclin 1 和LC3B 水平升高，PD 患者死后脑组织以及PD 细胞模型中自噬小体数目增加[16]，这与本研究结果类似。但有研究发现，帕金森病患者脑脊液中α-syn 及自噬相关指标蛋白LC3B、Beclin 1 和LAMP-2 水平低于健康对照者[17]，可能由于自噬与帕金森病的疾病进展有关，而该研究主要集中于帕金森病的早期。

α-syn 蛋白由SNCA 基因编码，其突变和过度表达参与PD 的发生与发展。当α-syn 蛋白合成、降解和分泌间的动态平衡被打破时，其神经毒性显著增加[18]。研究显示，α-syn 与自噬密切相关。KARIM等[19]发现，在小鼠模型过表达α-syn 时，非受体酪氨酸激酶（c-Abl）和 p53 被激活，自噬被抑制；反之，抑制 c-Abl 或 p53 后，AMPK 磷酸化水平增加，ULK1活化，mTORC1 信号下调，α-syn 聚集减少，神经元细胞自噬增加，从而延缓疾病进展。此外，本课题组前期研究发现，经6-OHDA 损伤后的SH-SY5Y 细胞中α-syn 表达增加，自噬水平被激活，而加入由皮肤前体分化而来的雪旺氏细胞后过度激活的自噬被抑制，细胞中α-syn 表达下调，并通过自噬抑制对PD 细胞模型提供神经保护[20]。本研究发现，PD 组血清α-syn 水平高于对照组，PD 中晚期组血清α-syn水平高于PD 早期组，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示血清α-syn 水平升高可能与PD 的发生和病程相关，可以作为疾病进展的预测指标，与肖成贤等[21]的研究结果基本相符。

总之，血清α-syn、LC3B 高表达可能参与PD 的发生发展，与疾病严重程度有关，但具体的分子机制仍有待进一步研究。