miR-96-5p 靶向叉头状转录因子O1 对Ishikawa 细胞的作用

冯艳奇，张娥，张蕾，郝颂华，倪婷婷

（1.河南医学高等专科学校妇科教研室，河南郑州 451191；2.河南中医药大学第一附属医院妇产科，河南郑州 450000；3.河南中医药大学，河南 郑州 450046）

子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势［1］。目前治疗子宫内膜癌的方法主要包括手术切除、放化疗法和激素疗法［2］。但是，由于晚期转移性或复发性子宫内膜癌患者失去了手术机会，治疗失败率较高，因此，需要研制新的治疗方法。目前，越来越多的分子靶向药物正在临床测试应用，且部分药物已显示出有效结果［3-4］。微小RNA（microRNA，miRNA）是可以调节一组靶基因并导致翻译抑制或mRNA 降解的分子［5］。最近的研究表明，子宫内膜癌中大量miRNA失调并调节细胞的生长和转移，继而影响肿瘤的发生和发展［6］。有研究发现，miR-96-5p 在结肠癌［7］、卵巢癌［8］和肺癌［9］中的表达均明显上调，并促进癌细胞的增殖和迁移；miR-96-5p在子宫内膜癌中表达上调，可能与患者不良预后相关［10］。而叉头状转录因子O1（forkhead box transcription factor O1，FOXO1）在各种癌症（包括子宫内膜癌）的进展中起抑癌作用［11］。因此，本文主要探讨了miR-96-5p 是否通过调控FOXO1影响子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭。

1 材料与方法

1.1 临床组织标本

收集2018 年4 月至2020 年5 月在河南中医药大学第一附属医院行子宫切除术的50 例患者子宫内膜癌和癌旁正常组织样本，-80 ℃保存。子宫内膜癌均经病理学确诊，且术前未接受过任何其他治疗。本研究经河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（批件号：HNZYYDXFSYY-2020-029），所有参与者均知情同意。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM 培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Gibco 公司）；Lipofectamine2000 和Trizol试剂（美国Invitrogen 公司）；cDNA 反转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒（日本TaKaRa公司）；CCK-8试剂、RIPA 裂解缓冲液、BCA 试剂盒和ECL发光剂（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗FOXO1 抗体（ab39670）、兔抗细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体（ab16663）、兔抗活化多聚ADP 核糖聚合酶（cleaved poly-ADP ribose polymerase，cleaved PARP）抗体（ab32064）、兔抗p21抗体（ab109520）、兔抗波形蛋白抗体（ab92547）、兔抗GAPDH（ab9485）（英国Abcam 公司）；辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗（#7074，美国CST 公司）；双荧光素酶报告系统（美国Promega 公司）。高速低温离心机（美国Beckman 公司）；Varioskan LUX酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；Promotor®实时荧光定量PCR 仪（杭州艾康生物技术有限公司）；Primo Star iLED 显微镜（德国蔡司公司）；电泳仪，电转仪（北京六一生物科技有限公司）；Tanon 3500凝胶成像系统（上海天能公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及细胞转染 子宫内膜癌Ishikawa 细胞购自美国菌种保藏中心（American type culture collection，ATCC）。Ishikawa 细胞在含有100 mL∕L FBS 的DMEM 培养基（含100 U∕mL 青霉素和100 µg∕mL 链霉素）于37 ℃和50 mL∕L CO2的加湿培养箱中培养。当细胞达到80%融合时，根据Lipofectamine2000试剂说明书进行转染。向Ishikawa细胞转染pcDNA、pcDNA-FOXO1、inhibitor NC、miR-96-5p inhibitor、mimic NC、miR-96-5p mimic以及共转染miR-96-5p mimic 和pcDNA-FOXO1，分别记为pcDNA 组、FOXO1 组、inhibitor NC 组、miR-96-5p inhibitor组、mimic NC 组、miR-96-5p组和miR-96-5p+FOXO1 组，对照组不进行转染。以上载体和基因序列均由上海吉玛基因公司设计和提供。

1.3.2 qRT-PCR 检测正常组织和子宫内膜癌组织中miR-96-5p 和FOXO1 mRNA 的表达 采用Trizol 试剂提取组织标本及转染细胞的总RNA，然后用分光光度计检测RNA 纯度。根据反转录试剂盒说明，取10 ng RNA 用于cDNA 合成。反应程序：16 ℃30 min；42 ℃30 min，85 ℃5 min。使用SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒进行qRT-PCR反 应，程序如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，40 个循环；以U6 或GAPDH 对照，采用2-ΔΔct法计算miR-96-5p 和FOXO1 的表达。qRTPCR 反应特异性引物如下所示：FOXO1，正向5'-TGGACATGCTCAGCAGACATC-3'，反向 5'-TTGGGTCAGGCGGTTCA-3'；GAPDH，正向5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向 5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；miR-96-5p，正向 5'-ACACTCCAGCTGGGTTTGGCACTAGCACATTT-3'，反向5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6，正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3.3 Western blot 检测FOXO1、cyclin D1、cleaved-PARP、p21 和Vimentin 蛋白表达 用RIPA 裂解缓冲液裂解组织，12 000×g离心后收集上清液，BCA测定蛋白浓度。凝胶电泳分离等量的蛋白质并电转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVD）膜。50 g∕L 的脱脂牛奶封闭后，PVDF 膜用抗GAPDH（1：1 000）、FOXO1（1：1 000）、cyclin D1（1：1 000）、cleaved PARP（1：1 000）、p21（1：1 000）和波形蛋白（1：1 000）的一抗4 ℃孵育过夜。然后用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶联的山羊抗兔二抗（1：3 000）在37 ℃下处理2 h，再用化学发光液观察蛋白条带。

1.3.4 CCK-8 法检测细胞活力 将传至第3～5 代的Ishikawa细胞接种于96孔板内，转染后各组连续培养24、48、72 h，每孔加入10 µL CCK-8 试剂，37 ℃培养2 h后使用酶标仪在450 nm检测吸光度。

1.3.5 Transwell 小室检测细胞侵袭情况 每个上室的膜用Matrigel（100 µg∕cm2）包被，然后37 ℃孵育过夜以胶凝。转染后Ishikawa 细胞重悬于无血清培养基中，并以3×104细胞∕孔密度接种到上层Transwell 室中。下室加入500 µL 含100 mL∕L FBS的DMEM培养基作为化学诱导剂。温育24 h后，除去未侵袭的细胞，用5 g∕L 的结晶紫对侵袭的细胞进行染色，并于显微镜下计数。

1.3.6 双荧光素酶报告基因验证实验 Targetscan网站预测分析FOXO1 3'UTR 上miR-96-5p 的结合位点。将FOXO1 wt 或FOXO1 mut 质粒分别与mimic NC 或 miR-96-5p mimic使用 Lipofectamine2000 试剂共转染至Ishikawa 细胞。培养48 h后，按照说明书操作测定细胞裂解液中的荧光素酶活性。

1.4 统计学处理

采用Graphpad 6.0 软件进行数据统计和分析。结果表示为平均值±标准差（），采用单因素方差分析数据，进一步两两比较采用LSD 检验；两个分类变量的关联程度分析，先采用χ2检验，再计算miR-96-5p 表达或FOXO1 表达与子宫内膜癌临床病理特征的关联系数φ或Cramér's V。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-96-5p 和FOXO1 在子宫内膜癌组织中的表达

qRT-PCR 和Western blot 检测结果显示，各组FOXO1mRNA 和蛋白表达水平差异有统计学意义（t=23.850，P＜0.001；t=33.99，P＜0.001；图1），各组miR-96-5p表达水平差异有统计学意义（t=12.550，P＜0.001）。与正常组织比较，子宫内膜癌组织中FOXO1mRNA 和蛋白表达量显著下调，miR-96-5p表达量显著上调（P＜0.001）。

图1 FOXO 1蛋白在子宫内膜癌组织中的表达Fig.1 Expression of FOXO 1 protein in endometrial carcinoma

2.2 miR-96-5p 和FOXO1 表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系

子宫内膜癌患者中miR-96-5p 高表达与病理分级和临床分期呈正相关（Cramér's V=0.367，P=0.034；φ=0.362，P=0.010），即随着miR-96-5p 表达升高，病理分级和临床分期等级越高，而与年龄和是否绝经无明显相关性（P=0.370，P=0.166）；子宫内膜癌患者中FOXO1 低表达与病理分级和临床分期呈负相关（Cramér's V=0.389，P=0.023；φ=0.384，P=0.007），即随着FOXO1 表达降低，病理分级和临床分期等级越高，与年龄和是否绝经无明显相关性（P=0.344，P=0.144；表1）。

表1 miR-96-5p和FOXO1表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系Table 1 Relationship between miR-96-5p and FOXO1 expression and clinicopathological features of endometrial carcinoma

2.3 FOXO1 过表达对子宫内膜癌Ishikawa 细胞存活和侵袭的影响

Western blot 实验结果显示，各组FOXO1 蛋白表达水平差异有统计学意义（F=123.400，P＜0.001）。与对照组比较，pcDNA 组FOXO1 蛋白表达量变化无统计学意义（P＞0.05），FOXO1 组Ishikawa 细胞中FOXO1 蛋白表达量明显上调（P＜0.01；图2A）。CCK-8 结果显示，各组吸光度值在总体差异上均具有统计学意义（F=17.890，P＜0.001）。如图2B 所示，与pcDNA 组比较，FOXO1组48 h 和72 h 的细胞活力均明显降低（P＜0.05）。Transwell 实验结果表明，2 组侵袭细胞数差异具有统计学意义（t=8.546，P=0.001）。Western blot结果显示，2 组中各蛋白表达水平差异具有统计学意义（cyclin D1：t=7.298，P=0.002；cleaved PARP：t=5.637，P=0.005；p21：t=5.040，P=0.007；Vimentin：t=8.328，P=0.001）。与pcDNA 组相比，FOXO1 组侵袭细胞数目明显减少（P＜0.01；图2C），Cyclin D1 和波形蛋白的表达水平明显降低，cleaved PARP 和p21 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01；图2D）。

图2 Western blot检测Ishikawa细胞FOXO1蛋白的表达情况Fig.2 Expression of FOXO1 protein of Ishikawa cell detected by Western blot

2.4 抑制miR-96-5p 表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞存活和侵袭的影响

qRT-PCR 结果显示，各组miR-96-5p 表达水平差异有统计学意义（F=137.600，P＜0.001）。与对照组比较，inhibitor NC 组Ishikawa 细胞中miR-96-5p 表达量变化无统计学差异（P＞0.05），miR-96-5p inhibitor 组中miR-96-5p 表达量明显下调（P＜0.05；图3A）。CCK-8 结果显示，各组吸光度值在总体差异上均具有统计学意义（F=10.320，P=0.003）。如图3B 所示，与inhibitor NC 组比较，miR-96-5p inhibitor组Ishikawa细胞48 h和72 h的细胞活力明显减弱（P＜0.05）。Transwell 实验结果表明，2 组侵袭细胞数差异具有统计学意义（t=12.480，P=0.002）。Western blot 结果显示，2 组中各蛋白表达水平差异具有统计学意义（cyclin D1：t=22.860，P=0.001；cleaved PARP：t=15.760，P=0.003；p21：t=12.280，P=0.002；Vimentin：t=18.070，P=0.001）。与inhibitor NC 组比较，miR-96-5p inhibitor 组侵袭细胞数明显减少（P＜0.01，图3C），cyclin D1 和波形蛋白的表达水平明显降低，cleaved PARP 和p21 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01；图3D）。

图3 抑制miR-96-5p表达对Ishikawa细胞活力和侵袭的影响Fig.3 Effects of inhibition of miR-96-5p expression on Ishikawa cell viability and invasion

2.5 miR-96-5p靶向负调控FOXO1的表达

Targetscan 预测结果显示，FOXO1 3'UTR 部分序列与miR-96-5p 互补配对（图4A）。荧光素酶报告基因实验结果显示，各组总体差异有统计学意义（F=47.000，P＜0.001）。如图4B 所示，与mimic-NC+FOXO1 wt 组比较，转染FOXO1 mut 的细胞荧光素酶活性无明显变化，miR-96-5p+FOXO1 wt 组细胞荧光素酶活性明显降低（P＜0.01）。qRT-PCR和Western blot 检测结果显示，各组FOXO1 mRNA和蛋白表达水平差异有统计学意义（F=236.000，P＜0.001；F=148.70，P＜0.001），各组miR-96-5p表达水平差异有统计学意义（F=241.600，P＜0.001）。如图4C-E所示，与mimic NC 组比较，miR-96-5p 组miR-96-5p表达明显上调，FOXO1mRNA和蛋白表达明显下调（P＜0.01）；与inhibitor NC 组比较，miR-96-5p inhibitor 组miR-96-5p 表达明显下调（P＜0.05），FOXO1mRNA 和蛋白表达明显上调（P＜0.01）。

图4 miR-96-5p靶向调控FOXO1的表达Fig.4 miR-96-5p targeted the expression of FOXO1

2.6 miR-96-5p 靶向调控FOXO1 促进Ishikawa细胞的活力和侵袭

CCK-8结果显示，各组吸光度值在总体差异上均具有统计学意义（F=8.126，P＜0.001）。与对照组比较，miR-96-5p 组Ishikawa 细胞活力明显升高，与miR-96-5p 组比较，miR-96-5p+FOXO1 组细胞活力明显降低（P＜0.05；图5A）。Transwell 实验结果表明，各组侵袭细胞数差异具有统计学意义（F=37.910，P＜0.001）。Western blot 结果显示，各组蛋白表达水平差异具有统计学意义（Cyclin D1：F=110.600，P＜0.001；cleaved PARP：F=34.200，P＜0.001；p21：F=81.120，P＜0.001；Vimentin：F=28.660，P=0.001）。如图5B-D 所示，与对照组比较，miR-96-5p 组侵袭细胞数明显增多（P＜0.01），cyclin D1 和波形蛋白表达水平明显升高，cleaved PARP 和p21 蛋白水平明显降低（P＜0.01），表明细胞凋亡被抑制；与miR-96-5p组比较，miR-96-5p+FOXO1 组侵袭细胞数明显减少（P＜0.01），cyclin D1和波形蛋白表达水平明显降低，cleaved PARP和p21蛋白表达水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01），表明细胞凋亡被诱导。

图5 miR-96-5p通过调控FOXO1表达对Ishikawa细胞活力和侵袭的影响Fig.5 Effects of miR-96-5p on Ishikawa cell viability and invasion by regulating FOXO1 expression

3 讨论

由于高复发、高转移、预后差及5 年生存率低，子宫内膜癌的临床治疗已越来越受到关注［3］。叉头蛋白家族成员FOXO1 转录因子是PI3K∕Akt 信号通路调控细胞存活的一个关键底物，在细胞的增殖、发育、凋亡和代谢的过程中发挥重要作用［12］。FOXO1 参与了包括子宫内膜癌在内的等多种癌症的发生发展，与癌症的进展、侵袭与转移密切相关［13-14］。MiR-96-3p 在多种肿瘤中发挥癌基因作用，Qin等［15］研究表明miR-96-5p可通过激活MEK∕ERK 信号传导促进乳腺癌的迁移。Wang等［16］研究表明miR-96-5p 可通过直接靶向FOXF2 促进口腔癌细胞的增殖和侵袭。

本研究结果表明子宫内膜癌组织中miR-96-5p 明显上调，FOXO1 明显下调，且在子宫内膜癌中miR-96-5p 高表达或FOXO1 低表达与肿瘤病理分级和临床分期具有相关性，与患者年龄和是否绝经无明显相关性。抑癌基因p21 通过停滞细胞周期，阻断细胞分裂，有利于基因组的损伤后修复［17］。Cleaved PARP 为Caspase 家族凋亡基因启动子，蛋白表达增加时说明细胞凋亡增加［18］。波形蛋白是间质标志物，在癌症转移等过程中发挥了重要作用［19］。过表达FOXO1 或抑制miR-96-5p 表达均明显抑制Ishikawa细胞的活力、侵袭及Cyclin D1和波形蛋白表达，明显促进cleaved PARP 和p21 蛋白表达，从而诱导细胞凋亡。上述结果揭示miR-96-5p在子宫内膜癌中发挥促癌作用，而FOXO1 起着抑癌作用。

一系列miRNA（miR-9、miR-27、miR-96、miR-153、miR-182、miR-183）明显降低了HEC-1B 细胞中FOXO1 的丰度，并促进子宫内膜的肿瘤发生［20］。此外，miR-135通过下调FOXO1明显刺激了Ishikawa细胞的增殖［21］。本研究结果显示，miR-96-5p直接靶向负调控FOXO1。miR-96-5p 过表达对Ishikawa 细胞活力和侵袭的促进作用可被过表达FOXO1 所逆转。因此，miR-96-5p 通过下调FOXO1 的表达水平在子宫内膜癌中发挥促癌作用。

综上所述，miR-96-5p 在子宫内膜癌中表达上调，FOXO1 表达下调，并与子宫内膜癌的临床分期和病理分级有关。miR-96-5p 通过靶向负调控FOXO1 的表达促进子宫内膜癌细胞的存活和侵袭，表明miR-96-5p可能成为治疗子宫内膜癌的有效靶点。