大熊猫粪便中mtDNA拷贝数与月龄的关系

任晓彤 周永恒 李天峰 李仁贵 马 跃，4 李德生 黄 炎 徐艳春，4，5*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.中国大熊猫保护研究中心，都江堰，611830；3.大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，都江堰，611830；4.国家林业和草原局野生动植物检测中心，哈尔滨，150040；5.国家林业和草原局野生动物保护与利用工程技术研究中心，哈尔滨，150040)

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数在其细胞能量代谢以及其他一系列细胞活动如钙信号、铁稳态、激素合成和细胞程序性死亡[1-3]中起着核心作用，单个哺乳动物细胞拥有成百上千个mtDNA拷贝，这种远高于核DNA(nuclear DNA，nuDNA)的拷贝数在哺乳动物基因组复杂的进化中发挥了关键作用，平均每个细胞内mtDNA拷贝数(Nmpc)反映着线粒体耗竭、能量储备和氧化应激等情况，也在一定程度上反映了机体当下的代谢状态[4]。据此推测，机体在生长发育和衰老的过程中可能伴随着一定规律的mtDNA拷贝数的变化。

粪便是动物的遗留物，也是动物研究中常用的非损伤性材料，无论是对野外还是饲养种群的采集都比较方便。粪便中包含的宿主DNA主要来自肠上皮细胞[5-6]，机体的生长发育和衰老伴随着肠道功能的发育和衰退，影响肠道的生理状态和代谢能力[7]，在这个过程中，作为能量供应中枢的线粒体中DNA拷贝数可能也会发生变动[8]，但是，变动的方式尚不了解。

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是世界瞩目的珍稀物种[9-10]，主要以竹子为食。竹纤维经过简单咀嚼后直接进入胃肠道，绝大多数的竹纤维都无法被消化分解[11]，经过肠道时，会黏附大量的肠道上皮细胞，并带入粪便中，为相关研究提供足够多、质量足够好的DNA。人工饲养种群具有准确的出生记录和详细的系谱信息，本研究选用出生月份记录清晰的圈养大熊猫的粪便为材料，研究肠道上皮细胞中mtDNA拷贝数与月龄的关系，以期揭示大熊猫不同生长发育和衰老阶段肠道代谢功能的变动规律，为饲养种群和野外种群的管理提供新的视角。

1 材料与方法

1.1 样本收集与粪便DNA提取

2021年6—7月从中国大熊猫保护研究中心的都江堰、核桃坪和耿达3个基地共采集64只11～357月龄的大熊猫的新鲜粪便(图1)。采集时用无菌手术刀和剪刀对每个粪便样本的顶部、尾部和中间3个部位切取表面的竹纤维，得到200～300 g的样品，立即置于冰箱中-20 ℃暂存，在干冰中运到实验室备用。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德国)，按照说明书的流程提取粪便总DNA。

图1 本研究采用的64只大熊猫的月龄分布

1.2 引物设计及有效性验证

通过实时定量PCR方法测定nuDNA和mtDNA的拷贝数。分别以大熊猫nuDNA(NCBI参考序列号：NC048220.1)上β-actin基因和mtDNA(NCBI参考序列号：NC009492.1)上Cytb基因为目的基因设计引物对，同时以大熊猫基因组为比对数据库通过NCBI-BLAST排除核内mtDNA片段(Numts)的干扰[12]，最终选择nuDNA的PCR引物对为Nβ(NβF：5′-GGGGATGGCGTTACTCATACT-3′；NβR：5′-ACATCACGAACAATCTCCCG-3′)，mtDNA的PCR引物对为MC(MCF：5′-AAGTGCCCCGCCACATATTT-3′；MCR：5′-GGTCGGAATATCATGCTTCGTTG-3′)。2对引物的熔解温度(melting temperature，Tm)均为60 ℃，片段长度分别为170、171 bp，引物由库美生物科技有限公司合成。

2个DNA片段采用相同扩增体系和扩增程序。扩增反应在10.0 μL体系中进行，包括2 ×RapidTaqMaster Mix(南京维诺赞生物科技有限公司)5.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.3 μL，DNA模板2.0 μL(～40 ng总DNA)，ddH2O 2.4 μL。混匀后瞬时离心，用9700型PCR扩增仪(GeneAmp，USA) 扩增。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 5 min。从2个扩增反应中分别取4 μL的扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，95 V下电泳25 min。

1.3 qRT-PCR荧光定量标准品制备

1.3.1 nuDNA和mtDNA目的基因片段处理

Nβ、MC2对引物的扩增体系等比放大至40 μL，将PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中，按照相同的条件电泳分离。紫外灯下切取2条目的条带，用DNA纯化回收试剂盒(Axygen，美国)分别进行回收，按照说明书操作。

纯化回收的DNA经超微量分光光度计(Implen，德国)检测浓度后，与pMD18-T载体(TaKaRa，日本)连接，将质粒转化至EscherichiacoliDH5α感受态细胞(TaKaRa，日本)中，通过蓝白斑筛选随机挑取10个白色菌落，转移至LB液体培养基中37 ℃下摇动培养16 h。吸取菌液1 μL，用1.2中的10 μL体系进行PCR扩增以及电泳检测。确定阳性后，用EasyPure®Plasmid MiniPrep Kit(Trans，北京)提取质粒，操作流程按照说明书进行。提取到的2种质粒用Sange法对插入片段测序，将测序结果在NCBI上比对，确认得到目的片段。

1.3.2 建立标准品浓度梯度

用所得的阳性质粒制备标准品。用微量分光光度计测定其浓度，按照公式计算质粒拷贝数(C)：

C=n×60.2×1014×(1/660N)。

式中：n为质粒浓度；N为插入片段的长度。

用灭菌的ddH2O按照10×等比例梯度稀释质粒，以稀释10-7～10-2的质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增以建立标准曲线，每个浓度做3个重复。荧光定量PCR反应在10.0 μL体系中进行，包括1.0 μL质粒溶液、5.0 μL TB Green Premix ExTaqⅡ(TaKaRa，日本)、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL和3.2 μL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；熔解段95 ℃处理15 s，60 ℃处理1 min，95 ℃处理15 s。反应用BTK-96实时荧光定量PCR分析仪(无锡百泰克生物技术有限公司)完成，绘制标准曲线。最终得到浓度为102～107拷贝/μL的标准品(Ct值10～30)。

1.4 粪便DNA中mtDNA拷贝数估算

将来自每个粪便样品不同部位的3份DNA稀释成近似浓度并等量混合，以此作为该个体的DNA样品。按照1.3.2中反应体系和程序，用Nβ和MC2对引物进行扩增，检测Ct值，并按照1.3.2中得到的标准曲线估算nuDNA和mtDNA的拷贝数。再根据公式计算平均每个肠上皮细胞中mtDNA的拷贝数(Nmpc)：Nmpc=2Nmt/Nnu，式中Nmt为样品中总mtDNA拷贝数；Nnu为样品中总nuDNA拷贝数。每个样品重复3次，取均值作为最终数据。

1.5 数据分析

根据3σ原则，把测得的Nmt、Nnu和Nmpc取值超出(μ-3σ，μ+3σ)区间的认定为异常值(μ为均值，σ为标准差)。检测到的异常值在后续分析中被剔除。对整理后的数据进行统计计算，得到Nmpc的平均值(mean)、标准差(SD)和变异系数(CV)；对所有个体的Nmt、Nnu和Nmpc取自然对数并做频率分布直方图；将个体月龄与Nmpc及ln(Nmpc)做线性回归分析，得到两者之间的关系；计算每个单独数据减去群体均值之后的绝对值作为变异度，与群体月龄做线性回归曲线。

考虑到性别对粪便DNA拷贝数的潜在影响，把Nmpc按照性别分组，分别计算雌、雄2组的平均值、标准差和变异系数；分别对雌、雄2组所有个体的Nmt、Nnu和Nmpc取自然对数并做频率分布直方图；由于样品中雌性和雄性月龄分布略有差异，按照性别及月龄层次分布进行分层随机抽样，减小月龄分布偏好度的影响，抽样比例设置为60%，对抽样数据取对数处理后进行秩和检验；分别将雌、雄2组的月龄与Nmpc做线性回归曲线；计算雌、雄2组的变异度，分别与群体月龄做线性回归曲线。以上分析均采用SPSS 24.0(IBM Corp.USA)完成。

2 结果与分析

2.1 引物对Nβ和MC的有效性

以3只大熊猫粪便总DNA为模板，引物对Nβ和MC均扩增了目的片段(图2)，表明这2对引物对nuDNA和mtDNA的扩增均是有效的。用大熊猫粪便DNA进行Nβ和MC引物的荧光定量PCR检验，引物Nβ和MC的熔解曲线如图3所示，熔点峰值分别为85.1、80.0 ℃，熔解曲线峰值点仅有1个且高度重合，说明引物无非特异性扩增以及二聚体，可用于样品拷贝数的分析。

图2 3只大熊猫Nβ和MC引物扩增产物的电泳结果

图3 引物Nβ(左)和引物MC(右)的qRT-PCR熔解曲线

2.2 qRT-PCR标准曲线

以菌液为模板，通过引物对Nβ和MC进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶上检测到在170 bp左右的条带；测得序列与NCBI上大熊猫的参考序列NC048220.1和NC009492.1的同源性均为100%，证明插入质粒的片段是目的片段。

经微量分光光度计测定，nuDNA质粒的初始浓度为129.00 ng/μL，mtDNA质粒标准品的初始浓度为119.95 ng/μL。通过计算得到的nuDNA和mtDNA拷贝数分别为6.92×1010、6.40×1010拷贝/μL。经过10×梯度稀释后，分别用引物对Nβ和MC的荧光定量PCR检测Ct值，并与实际拷贝数进行回归，绘制mtDNA和nuDNA 2种标准品的标准曲线，其中nuDNA的R2值为0.990，扩增效率(E)为97.95%，曲线方程Y=-3.811X+35.264；mtDNA的R2值为0.992，扩增效率为99.52%，曲线方程Y=-4.077X+39.063(图4)。最终得到的拷贝数检测下限为102。

图4 nuDNA(左)和mtDNA(右)标准品的qRT-PCR标准曲线

2.3 平均每个细胞mtDNA的拷贝数

将月龄和对应的Nmpc数据按照性别划分，雌性和雄性月龄分别为11～357、13～336月龄，平均值分别为172、123月龄；对应的Nmpc分别为24.00～7 803.00和46.00～8 467.00，平均值分别为1 177.00和1 990.00，标准差分别为1 840.34和2 449.51，变异系数分别为56.32%和123.08%；最终雌性和雄性的变异系数/平均月龄值分别为0.9%和1.0%。分别对雌、雄2组Nmt、Nnu和Nmpc进行自然对数转换后，其频率分布如图5(D-F为雌性，G-I为雄性)，对于雌性个体，Nmt跨度最大，Nmpc频率分布最集中且跨度最小，Nnu频率分布最分散；对于雄性个体，Nmt频率分布最集中且跨度最大，Nmpc跨度最小，Nnu频率分布最分散。对抽样数据进行性别和Nmpc的秩和检验，显著性为0.002。将每个性别的Nmpc进行自然对数转换后与月龄进行线性回归分析，结果显示2个性别中Nmpc都随着月龄的增加呈下降趋势，但趋势未达到显著水平(图7，雌性R2=0.060，P=0.176；雄性R2=0.110，P=0.074)。

图5 大熊猫粪便总DNA中Nmt、Nnu和Nmpc的频率分布

图6 大熊猫粪便总DNA中Nmpc及其变异度与月龄的相关性

图7 不同性别大熊猫粪便总DNA中Nmpc及其变异度与月龄的相关性

3 讨论与展望

生物体内线粒体功能的发挥随着个体生长发育而改变，长期以来，与衰老相关的线粒体功能下降一直被认为是多种生物学变化的基础，线粒体功能改变的机制涵盖多个领域，包括能量(ATP)产生和能量储备的下降[13-14]，自由基产生的增加[15]，凋亡和有丝分裂速率的改变，以及融合、分裂的改变。这些关键的细胞内变化会导致细胞功能障碍、组织改变和疾病风险增加[16]。已有一些研究证明mtDNA异质性与衰老之间具有相关性[17-20]，有关每个细胞的mtDNA分子的数量，即每个细胞mtDNA的拷贝数与月龄之间相关性的研究却很少。

机体细胞mtDNA拷贝数的普遍减少会破坏线粒体的整体效能，过度增加也会带来疾病风险[21]，如人类的mtDNA拷贝数改变与癌症、神经退行性疾病和糖尿病等衰老相关的疾病有关[22-23]。因此，从维持细胞和组织稳态的角度，mtDNA拷贝数应受到机体的严格控制。

本研究对大熊猫粪便中mtDNA拷贝数与月龄之间的相关性进行分析，发现mtDNA拷贝数随着月龄的增加呈现总体下降的趋势，并达到显著水平(P=0.004，图6A)。笔者推测这种趋势可能源于mtDNA拷贝数是线粒体复制和细胞能量转换的标志，当个体处于幼龄期时，基础代谢率较高，线粒体的总体活动更为活跃，导致细胞中mtDNA拷贝数普遍较高；而老年个体基础代谢水平降低[24]，在这一水平上维持能量转化的稳态所需的mtDNA拷贝数相对减少。

综上所述，本研究证明大熊猫肠道脱落上皮细胞中mtDNA拷贝数随着月龄的增加而减少，且减少速率逐渐放缓。无论老幼，拷贝数都存在着一个基本水平，反映了组织对线粒体发挥功能存在基本要求。此外，性别对于mtDNA拷贝数具有明显的影响，同一生长阶段的雄性比雌性更高。这些发现都为进一步探究肠道上皮细胞mtDNA拷贝数与生长发育和衰老之间的关系，以及利用其作为指标来评估机体的生理状况提供了依据。同时，本研究以粪便为材料获取肠道上皮细胞的机能状态信息，为进一步扩大粪便的应用范围提供了范例。