消毒剂种类及消毒时间对牡丹外植体的影响

张伟彬

（商丘职业技术学院 生物系，河南 商丘 476000）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.），又名富贵花、百两金，属芍药科、芍药属落叶亚灌木，是中国传统名花。牡丹栽培种类繁多，花姿艳丽、色泽鲜艳、气味芳香，自古以来深受人们的喜爱，是园林绿化常选材料。牡丹干燥后的根皮——丹皮，是一味重要的中药材，具有清热凉血、活血散瘀的功效。牡丹作为商品进行交易，始见于唐代。目前，牡丹的商品化生产取得了长足的发展，其产量不仅满足国内市场，还出口到法国、日本、美国、意大利、南非、柬埔寨等国家和地区，使中国牡丹誉满天下，取得了较大的经济效益。

牡丹喜阴，株型小，生长缓慢，容易在疏松、肥沃、排水良好的中性土壤或砂土壤中生长，不易在粘重土壤或低温处栽植。目前牡丹繁殖方式有2 种，即无性繁殖和有性繁殖。有性繁殖存在结实能力低下、种子变异性强、无性繁殖系数低等问题，限制了生产需要。生产牡丹若采用无性繁殖，不仅生长速度快，能在较短时期内扩大繁殖，且能保持母本的优良特性。与有性繁殖相比，无性繁殖技术不受季节、气候限制，还能在短时间内产生大量植株。牡丹需采用组织培养技术进行快速繁殖，才能实现批量化生产，促进产业化发展。

组织培养技术作为一项加快牡丹育种和繁殖步伐的新方法，不仅是促进牡丹产业化发展的重要技术，还是牡丹快速繁殖技术的最有效手段之一。但目前牡丹组织培养技术还没有形成完善的技术体系，存在试管苗玻璃化、褐化、污染、不易生根等问题。其中组织培养过程中造成污染的原因有很多，如外植体带菌、培养器皿消毒不彻底、操作时不规范等。导致培养污染的病源主要分为细菌和真菌两类。真菌性污染在接种7 d 左右出现，常表现为外植体长白毛。细菌性污染的主要表现是培养皿周边有粘液和发酵泡出现。

为保证培养物的无菌性，对观赏牡丹外植体的消毒方法进行试验研究，找出最佳消毒方法，以优化观赏牡丹的快速繁殖技术体系，为观赏牡丹的批量化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

牡丹品种为洛阳国际牡丹园的观赏牡丹——洛阳红（Paeonia.suffruticosaLuoYangHong），属1年生的中开花品种，株型高、直立，节间长，枝条长、较细而硬，植株生长势强。

试剂：70%酒精，0.1%HgCl2。

1.2 方法

1.2.1 鳞芽的处理 使用牡丹的鳞芽作为外植体材料，研究消毒剂与消毒时间对外植体的影响。分别设置70% 酒精和0.1%HgCl2消毒剂进行消毒处理，各消毒剂设置3 个不同消毒处理时间。70%酒精消毒处理时间分别为8 min、10 min、12 min；0.1%HgCl2消毒处理时间分别为5 min、8 min、12 min。消毒后的牡丹鳞芽接种到MS 培养基（不含激素）中，各处理鳞芽50 个，重复3次，10 d后观察统计。

1.2.2 叶片、叶柄的处理 使用牡丹的叶片及叶柄为外植体，以0.1%HgCl2为消毒剂，分别设置3个不同消毒时间处理，研究不同消毒时间下0.1%HgCl2对外植体的影响。叶片分别消毒处理1 min、3 min、5 min；叶柄分别消毒处理3 min、5 min、7 min。消毒后的叶片及叶柄切段，接种到MS 培养基（不含激素）中，各处理外植体50 个，重复3 次，15 d 后观察统计。

1.2.3 指标计算 使用Office Excel 2011、SPSS 3.0 对存活率、污染率、死亡率进行统计分析。

存活率=存活数/接种数×100%

污染率=污染数/接种数×100%

死亡率=死亡数/接种数×100%

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂不同消毒时间对鳞芽外植体的消毒效果

从表1可知，70%酒精对鳞芽外植体消毒处理时间为8 min、10 min、12 min 时，污染率均较高，分别为13.6%、10.0%、11.7%，总体呈下降趋势；随着消毒处理时间增加，存活率呈上升趋势，消毒处理时间为12 min时，存活率最高，为80.3%；随着消毒处理时间增加，死亡率呈下降趋势，消毒处理时间为12 min时，死亡率最低，为8.0%。

表1 2种消毒剂不同消毒时间处理鳞芽离体培养的存活率

0.1%HgCl2对鳞芽外植体消毒处理时间为8 min 时，污染率最低，为3.3%，存活率最高，为89.1%，死亡率最低，为7.6%；消毒处理时间为5 min 时，污染率较低，为3.5%，存活率次之，为68.7%，死亡率较高，为27.8%；消毒处理时间为12 min 时，污染率最高，为6.2%，存活率最低，为50.6%，死亡率最高，为43.2%。

试验表明，不同消毒剂种类的消毒效果不同，且同一消毒剂、不同消毒处理时间的消毒效果存在差异，消毒剂种类、消毒时间均会影响鳞芽的生长。使用0.1%HgCl2对鳞芽消毒处理效果最佳，最佳消毒处理时间为8 min，此时污染率和死亡率均最低，分别为3.3%、7.6%，存活率最高，为89.1%。

2.2 0.1%HgCl2对牡丹叶片及叶柄外植体的消毒效果

从表2可知，随着消毒时间增加，叶片污染率下降。与其他消毒处理时间相比，经过5 min 的消毒处理，叶片外植体污染率极低，为0%，死亡率最高，为71.8%，存活率最低，为29.2%；经过3 min 的消毒处理，污染率较低，为3.9%，存活率最高，为90.1%，死亡率最低，为6.0%；经过1 min 的消毒处理，污染率最高，为27.4%，存活率较低，为31.4%，死亡率较高，为41.2%。为保证外植体组织培养快速且有效地繁殖，0.1%HgCl2对叶片消毒处理3 min的消毒效果最佳。

表2 0.1%HgCl2不同消毒时间牡丹叶片及叶柄的的存活率

随着消毒处理时间增加，叶柄污染率呈下降趋势，经过5 min 的消毒处理，污染率较低，为4.5%，存活率最高，为82.1%，死亡率最低，为13.4%；经过7 min 的消毒处理，污染率最低，为3.3%，存活率较高，为75.6%，死亡率较低，为21.1%；经过3 min 的消毒处理，污染率最高，为6.1%，存活率最低，为68.3%，死亡率最高，为25.6%；为保证外植体的组织培养快速且有效繁殖，0.1%HgCl2对叶柄消毒处理5 min时的消毒效果最佳。

试验表明，同一消毒剂、不同消毒时间对外植体的消毒效果存在差异。使用0.1%HgCl2对叶片、叶柄的最佳消毒时间分别为3 min、5 min，此时叶片、叶柄污染率较低，分别为3.9%、4.5%，存活率最高，分别为90.1%、82.1%，死亡率最低，分别为6.0%、13.4%。

3 讨论与结论

目前，植物组织培养常用的消毒药品有0.5%～10%NaClO、酒精和HgCl2等。在牡丹离体组织培养快速繁殖的大量生产实践中，使用最多的外植体是鳞芽，同时也是最容易携带内生菌的组织，其污染率较高。在组织培养过程中，外植体预处理方法、消毒剂种类、消毒时间以及操作环境等因素均对组织培养产生较大影响。因此，外植体培养之前消毒是控制污染的重要手段之一。牡丹组织培养污染源主要有3个，一是外植体本身携带污染菌；二是在组织培养过程中消毒不彻底，如操作台、器具等；三是培养基灭菌不彻底。在牡丹的组织培养过程中，对外植体进行消毒是必须的。不同消毒剂种类的消毒效果不同，且同一消毒剂、不同消毒处理时间的消毒效果存在差异，消毒剂种类、消毒时间均会影响鳞芽的生长。因此，消毒剂的种类、消毒时间也是必须要考虑的因素。对于组织培养使用的消毒剂，既需要有较好的消毒效果，又不能损伤组织材料，同时还易洗净，避免影响后续外植体的生长与发育。因此，消毒剂的选用、适宜的消毒剂浓度及处理时间尤为重要。

试验表明，0.1%HgCl2较酒精适用于鳞芽的消毒，且最佳消毒时间为8 min，此时存活率最高，为89.1%，污染率和死亡率均最低，分别为3.3%、7.6%；0.1%HgCl2对叶片、叶柄消毒处理最佳时间分别为3 min、5 min，污染率分别为3.9%、4.5%，存活率分别为90.1%、82.1%，死亡率分别为6.0%、13.4%。