活动性肺结核患者血清CXCL10及CXCR3表达与CD27+CD4+ T细胞比例的相关性分析

李建军，吴素方，白丰玺

肺结核是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性传染性疾病，是一种严重威胁人类健康的全球性公共卫生疾病。我国肺结核发病率在世界范围内排名第3，近年来随着耐药结核增多及人口流动加剧等问题，肺结核防治依然任重道远[1-3]。研究发现，CXC亚类趋化因子及其配体在强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中发挥重要作用[4-6]。CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10，CXCL10)是CXC趋化因子家族成员，CXCL10可与其唯一受体CXC趋化因子受体3[chemokine(C-X-C motif) receptor 3，CXCR3]结合，主要表达于辅助性T淋巴细胞(Th)CD4+Th1细胞、CD8+T细胞等，在机体免疫反应抗MTB感染中发挥重要作用[7-8]。然而，目前关于CXCL10、CXCR3与活动性肺结核及CD27+CD4+T细胞的关系尚鲜有报道。本研究通过检测活动性肺结核患者血清CXCL10、CXCR3水平，分析其与CD27+CD4+T细胞水平的关联性及其临床意义，以期为活动性肺结核发病机制及临床诊疗研究提供参考。现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2019年4月至2021年4月我院收治的活动性肺结核患者100例(肺结核组)。男62例，女38例，年龄18～65(46.59±10.31)岁，体质量指数(body mass index，BMI)(23.67±2.45)kg/m2。另选择同期健康体检者96名作为对照组，男59名，女37名，年龄18～67(47.12±10.49)岁，BMI(22.86±2.31)kg/m2。两组患者性别、年龄、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获医院伦理委员会批准(审批号：20190305)。所有研究对象知情同意参与。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：(1)肺结核组痰涂片细菌培养显示结核杆菌阳性，胸部X线片发现阳性病灶，符合活动性肺结核的诊断标准[9]；(2)血液标本采集前未接受任何治疗；(3)临床资料完整。排除标准：(1)合并慢性阻塞性肺疾病、哮喘、慢性支气管炎症者；(2)合并严重心、肝、肾等重要脏器功能异常者；(3)合并乙型肝炎性病毒等其他慢性感染性疾病者；(4)合并糖尿病、高血压及自身免疫性疾病者。

1.3标本采集 收集活动性肺结核患者住院次日清晨及同期健康体检者空腹外周静脉血6 ml。取其中3 ml于常温以3 500 r/min(有效离心半径5 cm)条件离心10 min，分离血清。另3 ml加入Ficoll-Paque plus淋巴细胞分离液[中国爱必信(上海)生物科技有限公司]，制备外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。标本均立即送检或置于-80℃冰箱保存待检。

1.4血清CXCL10、CXCR3、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平检测 采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清CXCL10、CXCR3、IFN-γ、TNF-α水平，其中CXCL10检测试剂盒购自英国Abcam公司，CXCR3检测试剂盒购自中国南京森贝伽生物科技有限公司，IFN-γ和TNF-α检测试剂盒购自美国Invitrogen公司。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.5PBMC中CD27+CD4+T细胞水平检测[10]取100 μl PBMC悬液，分别加入10 μl抗CD27+PE、10 μl抗CD4+FITC进行染色，避光孵育30 min，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，3 500 r/min(有效离心半径5 cm)离心5 min后弃上清，最后加入磷酸盐缓冲液500 μl上机检测。采用FACS Canto II流式细胞仪(美国)检测PBMC中CD4+及其亚群CD27+CD4+T细胞水平。

2 结果

2.1两组血清CXCL10、CXCR3水平比较 肺结核组患者血清CXCL10、CXCR3水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组血清CXCL10、CXCR3水平比较

2.2两组PBMC中CD27+CD4+T细胞水平比较

肺结核组PBMC中CD27+CD4+T细胞占总CD4+T细胞的比例低于对照组，差异有统计学意义[(22.65±2.53)% vs (41.57±5.32)%；t=31.997，P=0.000]。

2.3两组血清IFN-γ、TNF-α水平比较 肺结核组患者血清IFN-γ、TNF-α水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组血清IFN-γ、TNF-α水平比较

2.4活动性肺结核患者血清各项指标相关性分析结果 Pearson相关性分析结果显示，活动性肺结核患者血清CXCL10与CXCR3、IFN-γ、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)，与PBMC中CD27+CD4+T细胞比例呈负相关(P<0.05)。血清CXCR3水平与血清IFN-γ、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)，与PBMC中CD27+CD4+T细胞比例呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 活动性肺结核患者血清各项指标相关性分析结果

2.5血清CXCL10、CXCR3诊断活动性肺结核效能分析结果 ROC曲线分析结果显示，血清CXCL10、CXCR3均具有诊断活动性肺结核的应用价值(P<0.05)，截断值分别为105.53 ng/L、295.72 ng/L。联合两个指标可进一步提高诊断活动性肺结核效能，灵敏度和特异度分别达94.00%、91.70%。见表4，图1。

表4 血清CXCL10、CXCR3诊断活动性肺结核的ROC曲线分析结果

图1 血清CXCL10、CXCR3诊断活动性肺结核的ROC曲线图

3 讨论

3.1MTB已经进化出先天性和适应性免疫逃避机制，以避免机体免疫介导的清除，这使得MTB能够建立进行性或潜伏性感染，并在宿主体内长期生存，即使在免疫功能正常的机体中也是如此[11-12]。有研究显示，通过与MTB接触而激活的巨噬细胞会分泌多种炎症介质，如TNF-α、白细胞介素-6等，影响炎症的发生、发展[13]。活动性肺结核主要是由于机体感染MTB后，免疫系统防御能力下降，临床症状显著，需要治疗且危害大。

3.2趋化因子及其受体与多种自身免疫性疾病的发生、发展有关，目前已发现约50种，其中针对CXC亚类和CC亚类的研究居多[14]。CXCL10可由IFN-γ诱导产生，而CXCR3是其唯一受体，二者均可表达于CD4+Th1细胞、CD8+T细胞等免疫细胞表面，CXCL10与CXCR3结合后可参与细胞生长、分化及炎症等多种生理、病理过程[15-16]。有研究显示，阻断CXCR3/CXCL10轴对免疫蛋白酶体功能障碍引起的炎症有明显的改善效果，CXCR3/CXCL10轴可作为治疗蛋白酶体相关自身炎症综合征的分子靶点[17]。有动物及人体研究实验显示，CXCL10在神经病理性小鼠及人体血清中均异常增加，可考虑作为诊断病理疼痛标志物[18]。赵嘉英等[19]研究报道，与健康对照组比较，干燥综合征患者血清CXCL10、CXCR3水平显著升高，与患者T淋巴细胞亚群异常有关，且对诊断干燥综合征有较高的灵敏度和特异度。本研究结果发现，与对照组比较，肺结核组患者血清CXCL10、CXCR3水平显著升高，提示血清CXCL10、CXCR3水平升高可能与活动性肺结核发生有关。故当临床检测血清CXCL10、CXCR3发生异常时，可以进一步根据患者临床症状、胸部X线检查结果等诊断活动性肺结核。

3.3CXCL10与其受体CXCR3结合还可趋化T淋巴细胞活化，与Th1淋巴细胞介导的免疫应答反应有关。林秋萍等[20]研究报道，在CXCL10趋化因子作用下，可使大量Th1细胞及其他免疫细胞活化并分泌IFN-γ、TNF-α等炎症因子，加大狼疮肾炎中肾损害作用。本研究结果发现，与对照组比较，肺结核组患者PBMC中CD27+CD4+T细胞水平降低，与血清CXCL10、CXCR3水平呈负相关；血清IFN-γ、TNF-α水平升高，与血清CXCL10、CXCR3水平呈正相关。CD27分子是TNF受体超家族成员，可稳定表达于T细胞表面，与其配体结合后可调节B细胞活化，促进免疫球蛋白合成[21]，CD27+CD4+T细胞水平降低，提示活动性肺结核患者可能存在T细胞亚群异常。IFN-γ可通过激活天然免疫系统发挥抗肿瘤作用，诱导产生CXCL10。而TNF-α是巨噬细胞分泌小分子蛋白，具有炎症介质作用。综合以上研究提示，活动性肺结核患者存在免疫异常及炎症反应，血清CXCL10、CXCR3水平升高可能与IFN-γ、TNF-α及CD27+CD4+T细胞异常有关。本研究进一步以血清CXCL10、CXCR3为检验变量进行ROC曲线分析，结果显示二者均具有诊断活动性肺结核的应用价值，截断值分别为105.53 ng/L、295.72 ng/L，灵敏度和特异度均超过80%。而二者联合可进一步提高诊断活动性肺结核效能，灵敏度和特异度均达90%以上，与赵嘉英等[19]的报道结果相似，提示血清CXCL10、CXCR3有潜力成为活动性肺结核诊疗的特异生物标志分子。

综上所述，活动性肺结核患者血清CXCL10、CXCR3水平显著升高，可能与IFN-γ、TNF-α水平升高及CD27+CD4+T细胞比例降低有关，联合检测血清CXCL10、CXCR3水平对活动性肺结核有一定诊断价值。但本研究样本量较少，且未能设置结核潜伏感染组，故研究结论尚需进一步完善设计后进行验证，对于血清CXCL10、CXCR3在活动性肺结核中具体作用机制及相关通路值得进一步深入探究。