抑制蚕豆鲜荚腐败菌的生物保鲜技术

宋居易，陈 惠，张 欣，刘 畅

(江苏沿江地区农业科学研究所，江苏南通 226012)

蚕豆是我国重要的经济植物，主要以鲜荚形式进入市场。蚕豆鲜荚在采摘后，由于受到温度、自身酶的作用导致品质变差的报道较多，而受到微生物影响的报道较少。实际上，蚕豆鲜荚在采摘、加工、贮藏过程中会受到多种微生物的侵染，导致褐变、腐烂和变软等，从而影响其风味、色泽、营养成分及货架期。因此，如何高质量地延长其货架期，对稳定市场、提高行业从业者经济收益进而激发行业活力具有相当大的意义。

蚕豆鲜荚作为一种农产品，与人们的生活健康息息相关。因此，在蚕豆鲜荚生产中，研发和利用有效的、安全无毒的、纯天然的、对环境友好的生物抑菌剂是研究热点之一。-葡聚糖是一种纯天然的抑菌物质，相关研究发现，-葡聚糖涂膜剂可以延长芒果、番茄等果蔬的货架期。植物精油是目前较热点的植物源抑菌剂，相关研究结果表明，多种植物精油复合使用对黄豆芽中微生物、牛肉腐败菌等有抑制作用。另外，溶菌酶、茶多酚是已被证明有良好效果的生物抑菌剂。

优势腐败菌(specific spoilage organism，SSO)是指在果蔬采摘、加工、贮藏过程中导致其品质变劣、占主导地位的部分微生物品种。通过抑制腐败菌来选择生物抑菌成分并进行复合保鲜的研究未见报道。笔者所在课题组已经从蚕豆鲜荚中分离出腐败菌并进行了回染试验，得到5种细菌(编号为B～B)和2种真菌(F、F)等7种优势腐败菌。本研究选择元麦-葡聚糖与植物精油、溶菌酶、茶多酚等生物抑菌物质进行处理，通过研究对蚕豆鲜荚优势腐败菌抑制的效果，确定有效生物抑菌成分，并与植酸、甘油进行复配，最后用响应面法优化得出高效、低成本、安全的复合保鲜剂配方，以期为其在蚕豆鲜荚的贮藏保鲜方面的应用提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验时间为2021年4—6月。蚕豆鲜荚取自江苏沿江地区农业科学研究所(地理位置：120°69′E，32°14′N)及附近农田。元麦-葡聚糖由笔者所在实验室自制。食品级大蒜精油、花椒精油、丁香精油、八角精油和生姜精油，均购自郑州雪麦龙食品香料有限公司。食品级茶多酚，购自索来宝生物科技有限公司。食品级溶菌酶和植酸，均购自浙江一诺生物科技有限公司。甘油，购自西陇化工股份有限公司。平板计数琼脂、PDA和牛肉膏蛋白胨培养基等生化试剂，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LRH-100CA型低温生化培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3C pH计，购自上海仪电科学仪器股份有限公司；SCL-1300型垂直流洁净工作台，购自北京赛伯乐实验仪器有限公司；LS-30 型立式压力蒸汽灭菌器，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 生物抑菌成分的抑菌性检验 植物精油(大蒜精油、花椒精油、丁香精油、八角精油和生姜精油)用20%乙醇制成5%的母液，用元麦-葡聚糖、溶菌酶和茶多酚制成3%的母液，稀释成不同浓度后使用。

将蚕豆鲜荚贮藏于点菜柜期间(温度变化范围为10～12 ℃)分离得到的7种优势腐败菌分别接种于细菌、真菌分离培养基上，按照Wang等的方法进行操作。

1.3.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用Liu等的方法进行操作，测定不同生物抑菌成分对蚕豆鲜荚优势腐败菌的MIC。

1.3.3 保鲜剂成分用量的筛选 分别设置丁香精油含量为0.3%、0.5%和0.7%，元麦-葡聚糖的含量为0.5%、1.0%和1.5%，植酸的含量为0.05%、0.10%和0.15%，甘油的含量为1.0%、1.5%和2.0%，以无菌蒸馏水处理作为对照组。

1.3.4 复合保鲜剂浓度的响应面优化 根据单因素试验的结果，按表1进行设计，以感官评定作为响应值筛选并进行验证试验。

表1 响应面试验因素水平编码

1.3.5 响应面优化复合保鲜剂验证试验 将蚕豆鲜荚分为2组进行装袋：试验组用经过优化的生物保鲜剂处理，对照组不加保鲜剂处理。分别于10 ℃贮藏20 d后，验证生物保鲜剂的保鲜效果。

1.3.6 保鲜指标的测定

1.3.6.1 菌落总数 测定方法具体参照GB 4789.2—2016《食品卫生微生物检验 菌落总数测定》。

1.3.6.2 感官评价 感官评定团由6名有感官评定经验的人员组成，总分在9分以下表示蚕豆鲜荚已不可食用。蚕豆鲜荚感官评分的具体指标见表2。

表2 蚕豆鲜荚的感官评定的具体指标

1.4 数据处理

用SPSS 24.0对试验结果进行分析，用Origin 9.1作图。

2 结果与分析

2.1 生物抑菌成分的抑菌效果

由表3可以看出，丁香精油对除B外的6种腐败菌均有抑制作用，且抑菌效果均较好，覆盖范围最广；元麦-葡聚糖、茶多酚均对B、B和B这3种腐败菌有较好的抑制作用，但元麦-葡聚糖的抑菌效果明显优于茶多酚，且元麦-葡聚糖也可以作为涂膜剂使用。基于抑菌广谱性、抑菌效果及涂膜功能，本研究选择丁香精油、元麦-葡聚糖作为生物抑菌成分进行下一步研究。

表3 8种生物抑菌剂对冷藏蚕豆鲜荚腐败菌的抑菌圈直径

2.2 生物抑菌成分对蚕豆鲜荚腐败菌最小抑菌浓度的影响

各试验组主要通过牛津杯法研究丁香精油、元麦-葡聚糖对7种腐败菌的抑菌作用，得出相对应的MIC(表4)，从而确定单因素试验中各因素的取值范围。

表4 不同生物抑菌成分下的蚕豆鲜荚腐败菌MIC

2.3 保鲜剂成分的单因素试验结果

2.3.1 丁香精油用量的筛选 由图1可知，0.3%丁香精油处理的抑菌能力、感官评分明显比0.5%、0.7%丁香精油处理的低，可能是由其浓度低造成的，而0.5%丁香精油处理的感官评分在贮藏20 d内均最高，因此选择0.4%～0.6%作为丁香精油适宜的保鲜含量范围。

2.3.2 元麦-葡聚糖用量的筛选 如图2所示，随着元麦-葡聚糖浓度的增加，抑菌效果越好，1.5%元麦-葡聚糖处理的感官评分低于1.0%元麦-葡聚糖处理，这可能是由于高浓度的元麦-葡聚糖较黏稠，不易形成干燥的薄膜，因此选择0.8%～1.2%作为元麦-葡聚糖的适宜用量范围。

2.3.3 植酸用量的筛选 如图3所示，0.05%植酸处理组比其他2个处理组的感官分值低，其他2组的差异不明显，而且0.10%植酸处理组的感官分值更高一些。因此选择0.08%～0.12%作为植酸适宜保鲜用量范围。

2.3.4 甘油用量的筛选 由图4可知，对照组的感观评分值持续下降，贮藏10 d内添加甘油处理后，样品的感官评分下降趋势较缓慢。但是贮藏20 d后，样品品质都下降，都超过规定标准，基本失去食用价值。在这个过程中，1.5%甘油处理组的感官分值更高一些，可能因为1.0%甘油形成的膜比较薄，抑制呼吸作用、水分损失的能力略差，而2.0%甘油形成的膜略厚，透气性不好，因此选择1.2%～1.8%作为甘油的适宜用量范围。

2.4 响应面优化试验结果

2.4.1 中心组合设计试验结果 用Design-Expert 10.0对表5中的数据进行分析，得到感官评价分值对丁香精油、元麦-葡聚糖、植酸和甘油用量这4个因素的二元回归方程模型为=2489+108+072+040+030+049+003-014+009-008+017-132-194-142-120。式中：为感官评价分值；为丁香精油用量；为元麦-葡聚糖用量；为植酸用量；为甘油用量。

表5 响应面试验方案及结果

如表6所示，该模型达到极显著水平(<0.000 1)，失拟项不显著，说明方程拟合程度较好；方差分析结果还说明，一次项都有显著或极显著影响，说明丁香精油、元麦-葡聚糖、植酸和甘油用量4个因素对蚕豆鲜荚感官评价分值有很强的影响，影响感官评分的各因素排序为丁香精油用量>元麦-葡聚糖用量>植酸用量>甘油用量；交互项中AB达到显著水平(<0.05)。

表6 回归模型的方差分析结果

如图5所示，丁香精油、元麦-葡聚糖的响应面图形的曲线较陡，其等高线为椭圆形，说明两者的交互作用显著，即同时使用可以产生协同作用，从而起到更好的效果。

2.4.2 最优条件优化 根据Design-Expert 10.0分析和数据优化，得到最优工艺条件，以质量体积比计：丁香精油用量为0.48%，元麦-葡聚糖用量为0.80%，植酸用量为0.12%，甘油用量为1.20%。通过3次验证试验，保鲜处理20 d后的感官评分值达到23.18分，菌落总数为4.09 lg CFU/g，接近预测值，说明利用响应面法优化配方是可行的。按照最优工艺条件进行处理的蚕豆鲜荚明显优于同等贮藏条件下未经过保鲜剂处理的，其感官评分为3.27分，菌落总数为8.23 lg CFU/g。刘小芳等研究发现，新鲜净菜活菌数应低于5 lg CFU/g。由此可见，复合保鲜剂处理的样品符合规定。

3 讨论与结论

笔者在对元麦-葡聚糖进行研究的过程中发现，它对一些致病菌和腐败菌有一定的抑制作用，经初步试验，发现其在蚕豆鲜荚保鲜上也有较好的抑菌效果。元麦-葡聚糖的抑菌谱虽然没有丁香精油广，但是它们可以在抑菌种类在上形成互补；其次，它可以在蚕豆鲜荚上形成涂膜，减弱其呼吸作用，延缓后熟，这与闫子娇等的研究结果相类似。加入甘油作为增塑剂，会与多糖共同作用，提高成膜品质，抑制果蔬呼吸和蒸腾作用，从而维持果实的品质。褐变是蚕豆鲜荚在采摘后极易发生的一种现象，酶促褐变是引发的主要原因之一。植酸是一种天然物质，具有抗氧化性和护色作用，从而达到保鲜的目的。

采用响应面法建立丁香精油、元麦-葡聚糖、植酸、甘油用量与感官评分之间的二次多项回归模型，得到优化的蚕豆鲜荚的保鲜剂配方，以质量体积比计：丁香精油用量为0.48%、元麦-葡聚糖用量为0.80%、植酸为0.12%和甘油为1.20%；在此配方下蚕豆鲜荚保鲜20 d后感官评价分值为23.18分，表明响应面法用于配方优化是可靠的。在此条件下，蚕豆鲜荚冷藏20 d期间，最佳配方试验组在菌落总数、感官评分上均优于对照，表明丁香精油、元麦-葡聚糖、植酸和甘油保鲜组合可延长蚕豆鲜荚的货架期至20 d以上，同时为蚕豆鲜荚新型生物保鲜剂的研制提供依据。