冷藏蚕豆鲜荚优势腐败菌的分离与鉴定

宋居易，张 欣，刘 畅，陈 惠

（江苏沿江地区农业科学研究所，江苏 南通 226000）

蚕豆（Vicia fabaL.）系豆科豌豆属一年生或越年生草本植物，为世界排名第三的食用豆类作物[1]。蚕豆籽粒营养价值很高[2]，江苏沿江地区及沪、浙等地是我国鲜食蚕豆的重要产地[3]，该地区有食用鲜蚕豆的消费习俗，且市场需求量较大。然而，蚕豆鲜荚的产业受许多因素的制约（如上市时间多集中在5月，气温较高，不耐贮藏，货架期短）而难以进一步发展，故短期内极易形成供大于求的局面，从而致使销售价格过低[4]，农民增产不增收。如何延长蚕豆鲜荚货架期，成为鲜食蚕豆产业发展中需待解决的重要问题。

优势腐败菌（Dominant spoilage organism,DSO）是指在果蔬采摘、加工、贮藏过程中使其品质劣变起主导作用的微生物[5]。蚕豆鲜荚在收获后，由于温度、自身所含酶的作用，以及微生物的快速繁殖、入侵导致腐烂，呼吸和蒸腾作用加剧，并产生纤维化现象，使其食用价值严重降低。目前，关于蚕豆鲜荚由于受到贮藏温度[6-7]和自身所含酶（如多酚氧化酶和过氧化物酶等）[8-11]的作用导致品质劣变的研究较多，但是关于蚕豆鲜荚优势腐败菌的研究报道较少。优势腐败菌与蚕豆鲜荚货架期有很大相关性，是其质量监控的重点，因此特定腐败菌的确定对靶向抑制蚕豆变质和延长其货架期具有较大意义。

前期试验显示，10 ℃下对蚕豆鲜荚进行贮藏保鲜不仅贮藏品质较好，而且成本低。因此，本研究从10 ℃贮藏条件下腐败的蚕豆鲜荚样品中分离数量优势的菌株，通过形态学结合16S rDNA 和内部转录间隔区（ITS）测序法进行菌种鉴定，并以菌落总数和蚕豆鲜荚感官评定为评价标准，研究优势腐败菌的致腐能力，旨在为蚕豆鲜荚保鲜技术的开发利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

蚕豆鲜荚：由江苏沿江地区农业科学研究所提供。

牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖（PDA）培养基，北京索莱宝公司；基因组DNA 提取试剂盒，北京擎科新业生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

LS-30 型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DNP-9162 型电热恒温培养箱，上海精宏试验设备有限公司；SCL-1300 型垂直流洁净工作台，北京赛伯乐实验仪器有限公司；CX41 显微镜，日本奥林巴斯公司；GB303 电子天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蚕豆鲜荚腐败菌的分离纯化

蚕豆鲜荚经低聚乙烯袋包装后，10 ℃下贮藏直至腐败，参考潘梦诗等[12]的方法取样分离菌株，将菌液稀释到合适的浓度，吸取0.1 mL 涂布于相应菌株筛选培养基上，放入恒温箱中培养。待菌落长成后，挑选多而不同的菌落，划线获得纯化的单菌落，4 ℃储存备用。

1.2.2 腐败菌的鉴定

采用显微镜对筛选的菌株进行初步的形态观察。采用分子生物学16S rDNA 和ITS 菌种鉴定的方法，对腐败菌进行鉴定。参照顾春涛等[13]的方法进行DNA提取，回收目标PCR 产物，测序比对，运用Geneious软件构建系统发育树。

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 腐败菌致腐能力

在经消毒处理的操作台上，将分离纯化后的各菌株活化后，分别制成适宜浓度的菌液，把蚕豆鲜荚分别浮于其中接种，初始接种量均为104～105CFU/g，处理后的蚕豆鲜荚于10 ℃条件下保存。以未接种腐败菌的蚕豆鲜荚为对照，以菌落总数和蚕豆鲜荚感官评分为评价标准，研究腐败菌的致腐能力。

1.2.3.2 菌落总数

参照GB 4789.2—2016[14]中的方法进行测定。

1.2.3.3 感官评定

由6 名有经验的人员组成感官评定小组。总分在12 分以下表示蚕豆鲜荚开始腐败，总分9 分以下表示蚕豆鲜荚不可食用。蚕豆鲜荚感官评分标准见表1。

表1 蚕豆鲜荚感官评分标准Table 1 Sensory evaluation criteria of fresh pods of broad bean

1.2.4 数据处理

采用SPSS 24.0 软件对试验结果进行分析，利用Origin 9.1 软件作图。

2 结果与分析

2.1 蚕豆鲜荚贮藏过程中腐败菌的分离结果

由图1 所示，采用平板划线法进行分离和纯化，共分离出5 株细菌（B1～B5）和2 株真菌（F1～F2）。

图1 蚕豆鲜荚10 ℃贮藏条件下的腐败菌Fig.1 Spoilage microorganism in fresh broad bean pods stored at 10 ℃

2.2 腐败菌的鉴定结果

腐败菌的菌落形态特征如表2 所示。对5 株细菌进行革兰氏染色后，发现菌株B1、B2、B3、B4为革兰氏阴性菌，菌株B5为革兰氏阳性菌（图2）。

表2 蚕豆鲜荚腐败菌的形态学特征Table 2 Morphological characteristics of spoilage organism in fresh broad bean pods

图2 蚕豆鲜荚5 株细菌（B1～B5）和2 株真菌（F1～F2）显微形态图Fig.2 Micromorphology diagram of 5 strains(B1～B5)of bacteria and 2 strains(F1～F2)of fungi in fresh broad bean pods

结合分子生物学方法，对目标菌进行基因组DNA提取、扩增，结果如图3 所示。5 株细菌在1500 bp 左右均出现稳定、清晰的较强条带，说明细菌均被成功扩增。真菌F1和F2在250～500 bp 左右出现较强的目标条带，表明其也被成功扩增。

图3 蚕豆鲜荚腐败菌的PCR 产物电泳图Fig.3 Electrophoretic diagram of PCR products of spoilage organism in fresh pods of broad bean

将上述条带回收后进行序列测序，通过GenBank中的BLAST 软件进行比对，获得与其同源性较高的相似序列，使用Geneious 软件构建系统发育树（图4）。结果显示：B1与成团泛菌（Pantoea agglomerans），B2与嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），B3与韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis），B4与水生拉恩菌（Rahnella aquatilis），B5与高山芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），F1与 枝 胞 属 菌Cladosporium xanthochromaticum，F2与球孢白僵菌（Beauveria bas-siana）的亲缘关系最近，同源性较高。

图4 蚕豆鲜荚腐败菌的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of spoilage microorganism in fresh broad bean pods

2.3 优势腐败菌致腐能力测定结果

如图5A 所示，冷藏蚕豆鲜荚接种优势腐败菌后，菌落总数均随着贮藏时间的延长呈增加趋势，对照组增加较为缓慢，贮藏4 d 时，韩国假单胞菌、成团泛菌和嗜麦芽寡养单胞菌菌落总数均已超过蔬菜初期腐败所规定的6.0（lg（CFU/g））[15]，贮藏至第8 天时，除对照外，其他7 株菌菌落总数均超过标准[15]。贮藏至第10 天时，菌株B3、B1、B2、B4、B5、F1、F2的菌落总数分别达到8.54、8.07、7.74、7.56、7.02、6.88、6.80（lg（CFU/g）），均高于对照组。

由图5B 可知，接种7 株菌后的蚕豆鲜荚感官评分均随贮藏时间的延长呈下降趋势，且均低于对照组。贮藏至第6 天时，接种韩国假单胞菌和成团泛菌的蚕豆鲜荚感官评分分别为7.27 分和8.91 分，蚕豆鲜荚已不可食用；第8 天时，接种不同菌株的蚕豆鲜荚感官评分分别为：嗜麦芽寡养单胞菌7.01 分，水生拉恩菌7.41 分，高山芽孢杆菌8.71 分，枝孢属菌8.91分，球孢僵白菌8.99 分，均已不可食用；对照组蚕豆鲜荚贮藏至第10 天时，感官评分为9.87 分，已开始腐败。结合图5A 中的菌落总数可知，致腐能力较强的腐败菌为B3、B1、B2和B4，较弱的为B5、F1、F2。

图5 不同腐败菌对蚕豆鲜荚菌落总数（A）和感官评分（B）的影响Fig.5 Effect of different dominant spoilage organism on total colony count(A)and sensory score(B)of fresh pods of broad bean

根据贮藏腐败时的菌落数量优势和致腐能力较强两方面确定优势腐败菌的原则[16]，最终确定B1菌株（成团泛菌）和B3菌株（韩国假单胞菌）为10 ℃贮藏条件下蚕豆鲜荚的优势腐败菌。

3 讨论与结论

本试验分离得到的数量优势腐败细菌主要为Pantoea agglomerans、Pseudomonas koreensis、Stenotrophomonas maltophilia、Rahnella aquatilis和Bacillus altitudinis。肠杆菌科在新鲜农产品中含量丰富[17]，成团泛菌为肠杆科菌中的一员，其为新鲜绿豆芽、菠菜和胡椒微生物群的主要成员[18]。Keshria 等[19]在对绿豆芽腐败菌的研究中发现，假单胞菌属、泛菌属细菌是其优势腐败菌。假单胞菌属是在土壤中发现的一种高度异质性的腐生菌，其包括人类和动植物的条件致病菌、有机物及植被分解者[20-21]。有研究表明[22]，假单胞菌属成员在萝卜芽、苜蓿、绿豆和西兰花芽中含量丰富，如荧光假单胞菌和黄绿假单胞菌[23]。嗜麦芽窄食单胞菌、芽孢杆菌属和拉恩氏菌属在其他研究中也是优势腐败菌[24-26]。而在其他一些研究中，肠杆科菌中的欧文氏菌属是主要的优势腐败菌[27-29]。本试验分离得到的数量优势腐败真菌为Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。Cladosporium xanthochromaticum在某些食物中也是常见的优势腐败菌[30]。

由于在冷藏条件下，细菌比真菌容易生长，更容易成为优势菌，所以细菌比真菌更易导致冷藏新鲜蔬菜和瓜果的采后腐败[30]。本试验结果表明，韩国假单胞菌和成团泛菌是冷藏蚕豆鲜荚的优势腐败菌。韩国假单胞菌和成团泛菌腐败能力强可能是因为以下两个原因：①它们可以产生过氧化氢酶、氧化酶（大多数）和催化蛋白质水解和脂解反应的酶，从而导致冷藏新鲜产品的腐败[31]；②它们可以攻破植物防御机制[32]，利用植物营养素，如果胶酶、聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶甲酯酶（PME）等对植物果胶进行降解、液化，进而导致植物腐烂。植物组织遭到破坏后，导致更多的细菌和真菌进入，从而加快和加重腐败。

本研究从在10 ℃条件下放置腐败的蚕豆鲜荚表面分离得到的数量优势腐败菌为Pantoea agglomerans、Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas koreensis、Rahnella aquatilis、Bacillus altitudinis、Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。对蚕豆鲜荚的致腐能力大小排序为Pseudomonas koreensis＞Pantoea agglomerans＞Stenotrophomonas maltophilia＞Rahnella aquatilis＞Bacillus altitudinis＞Cladosporium xanthochromaticum＞Beauveria bassiana。Pseudomonas koreensis和Pantoea agglomerans为10 ℃贮藏条件下蚕豆鲜荚的特定优势腐败菌。以上结果可为蚕豆鲜荚生物保鲜技术的研究提供理论依据。