女贞种子休眠机制和萌发特性研究

吴 红，燕丽萍，夏 群，赵嘉豪，程天利

(1.江苏农牧科技职业学院园林园艺学院，江苏泰州 225300；2.山东省林业科学研究院/山东省林木遗传改良重点实验室，山东济南 250000)

具有生活力的成熟种子在适宜的环境条件下也不能立即萌发，必须经历一个相对静止的阶段，这种现象叫种子的休眠，种子休眠是种子在长期系统发育过程中获得的一种抵抗外界不适宜环境的适应性，而在农业生产上，种子的休眠严重限制了种子生产以及种子的扩繁应用。因此，种子休眠机制以及打破种子休眠方法的研究是种子开发利用的重要保障。近年来，国内外学者已广泛开展了多种作物种子休眠机制研究，刘洋等对乌苏里鼠李()种子休眠的特性进行研究发现，该种子为综合休眠型，是由种皮障碍和内源抑制物质共同导致休眠；张云等通过对膜苞鸢尾()种子的研究发现，膜苞鸢尾种子胚无休眠特性，种皮和胚乳束缚是造成种子休眠的主要原因。另外，国内外学者关于破除种子休眠的方法也开展了大量的研究，如金银花()种子低温层积75 d能够有效解除种子休眠；用刀刺破种皮或用96%浓硫酸浸种能打破西藏砂生槐()种子的休眠，提高发芽率。

女贞()为木樨科(Oleaceae)女贞属()植物，原产于我国，现广泛栽植于长江流域及华南、西南地区，向西延伸至陕西、甘肃等地。女贞四季婆娑，树形整齐，适应性强，是园林中常用的观赏树种。从女贞叶中提取的冬青油具清香味，可用作甜食和牙膏的香料；冬青油还具有镇痛、消炎、抗风湿和祛风等作用，可用来治疗肌肉疼痛。林文群等的研究表明，女贞种子含有女贞子酸(ligustrin)、甘露醇(mannitlo)、齐墩果酸(oleanolic acid)、熊果酸(ursolic acid)、桦木醇(betulin)等，有滋养肝肾、强腰膝、乌须明目的功效。国内学者对女贞的栽培技术、抗逆生理和病虫害防治等方面进行了研究。对种子的研究多集中在播种技术方面，如种子播种品质性状、种子种苗地理变异及苗期抗寒性的研究、种子化学成分的研究、女贞种子和幼苗对模拟酸雨的反应，而对其种子萌发特性特别是种子体眠机制以及破除种子休眠的方法研究还未见报道。本研究以女贞种子为研究对象，通过对其种子吸水特性、种皮(果皮)的机械阻力等进行研究，探讨女贞种子的休眠机制和萌发特性，并通过HSO溶液、NaOH溶液、浸种和低温层积等处理来研究快速破除女贞种子休眠的方法，以期为女贞的种质资源利用，大规模育苗提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2020年8月采集江苏农牧科技职业学院(32°01′57″～33°10′59″E，119°38′24″～120°32′20″N)校内实训基地内果皮呈现紫色的女贞果实，用手搓洗去除果皮和果肉，自然干燥后挑选饱满的种子置于牛皮纸袋内存于0～4 ℃冷库。内源性物质试验所用青杂三号白菜()种子购自江苏中江种业股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子形态特征和千粒质量测定 采用放大镜观察种子外部状况(形状、颜色以及种皮和果皮特性)；采用精度为0.05 mm的游标卡尺测定种子的纵径和横径；采用感量为0.001的电子天平测定种子的千粒质量，重复8次取其平均值。

1.2.2 女贞种子吸水率的测定 种子吸水特性的测定参照GB 2772—1999《林木种子检验规程》中介绍的方法，取上述自然风干的去壳和未去壳的种子各100粒，置于200 mL烧杯内，加入水量没过种子表面，于25 ℃的恒温箱浸种。重复3次。定期取出(白天每2 h 1次、夜间每4 h 1次)种子，用滤纸吸干种子表面水分，用感量为0.001 g的电子天平测定种子质量，依次重复至种子质量不再变化为止。

种子吸水率计算公式：=(-)×100%。

式中：为女贞种子的吸水率；为种子浸种后的质量；为种子浸种前的质量。

1.2.3 种子发芽试验 采用喻梅等介绍的纸上发芽法，在25 ℃光照培养箱中进行，光/暗周期为 12 h/12 h，每皿50粒，3次重复；种子发芽期间逐日记录，种子露白视为发芽，记录种子发芽数，当供试种子连续5 d不萌发时视为发芽结束，根据以下公式计算女贞种子发芽率和发芽势。

发芽率()=()×100%；

发芽势()=(/)×100%。

式中：为发芽种子数；为供试种子数；为发芽最高峰时发芽种子数。

1.2.4 离体胚培养 随机取女贞种子200粒，用蒸馏水浸泡24 h后去壳，分4组每组50粒进行离体胚试验，处理如下：(1)去除全部胚乳，只保留胚；(2)去除子叶端胚乳，露出1/2子叶；(3)去除胚根端胚乳，露出1/2胚根；(4)保留全部的胚乳。每组重复3次，上述材料分别置于洁净培养皿中，皿中铺2层洁净滤纸并用去离子水浸湿，然后将培养皿置于25 ℃光照培养箱内培养，统计各组萌芽情况。

1.2.5 内源性物质提取及白菜籽发芽的测定 随机取新鲜女贞种子，剥取木质化的内果皮和胚乳，用感量为0.001 g的电子天平称取上述材料各5 g，置于预冷的研钵中研碎，用80%甲醇溶液转移于 25 mL 试管中，后置于4 ℃冰箱中浸提48 h，期间不断振荡以保证提取充分，然后离心取上清液，重复以上操作并将上清液混合置于50 ℃烘箱内浓缩蒸干并用蒸馏水定容至50 mL备用。分别取定容后的浸提液1、2、3、4、5 mL用蒸馏水定容至5 mL配制成20%、40%、60%、80%、100% 的溶液，浸泡白菜种子，将浸泡种子置于25 ℃光照培养箱中培养，测定白菜种子的发芽率，每个处理重复3次，以蒸馏水浸泡为对照。

1.2.6 种子解除休眠方法研究

1.2.6.1 HSO、NaOH溶液处理对女贞种子萌发特性的影响 女贞种子用体积分数为98% 的HSO溶液浸种处理10、20、30、40、50 min；或者用0.3 mol/L的NaOH溶液浸种6、12、18、24、36 h，浸种后的种子用蒸馏水冲洗3次，以未浸种的种子为对照，参照“1.2.3”节中的方法测定种子的发芽率和发芽势，每个处理50粒种子，3次重复。

1.2.6.2 浸种水温和时间对女贞种子萌发特性的影响 用20、35、50、65 ℃的自来水分别处理女贞种子4、6、8、10、12、16 h，以未浸泡的种子为对照，处理结束后参照“1.2.3”节中的方法测定种子的发芽率，每个处理50粒种子，3次重复。

1.2.6.3 低温层积处理对女贞种子萌发特性的影响 将沙(最大持水量50%)与女贞种子以3∶1的比例(体积比)埋藏于塑料花盆中，后置于4 ℃条件下保存。每隔3 d喷水并翻动以保证塑料花盆内的湿度和通气环境。层积30、50、70、90 d，以未层积处理的种子为对照。处理结束后参照“1.2.3”节中的方法测定种子的发芽率，每个处理50粒种子，3次重复。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel及DPS v7.05进行数据分析和作图，各处理采用最小显著性差异()法对数据进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 种子形态特征和千粒质量测定结果

女贞种子为肾形，两端尖细，成熟时为黄褐色至棕褐色，千粒质量为32.17 g，种子纵横径比为2.19；种子由种皮、胚乳和胚3个部分组成，成熟的种子外被一层木质化的内果皮，种皮褐色膜质化，种皮内为厚而坚硬的胚乳，是种子的重要组成部分，胚包埋于胚乳内，体积小，子叶发达且下胚轴长(图1)。

2.2 女贞种子的吸水率变化

女贞种子吸水率变化情况如图2所示。随着女贞种子吸水时间的延长，吸水速率逐渐增加，去壳和未去壳种子的吸水率曲线变化一致，但去壳种子的吸水率大于未去壳种子。由图2可知，女贞种子物理吸水过程包括3个时期：0～8 h为种子快速吸水期，吸水量大而迅速，8 h时去壳和未去壳种子吸水率分别达到63.89%、37.90%；8～28 h为缓慢吸水期，种子吸水缓慢但历时长，在28 h时去壳和未去壳种子的吸水率分别为77.46%、57.30%；28～48 h为饱和吸水期，吸水量逐渐趋于平衡，在饱和吸水末期，去壳种子已完成种子总吸水量的84.09%，几近饱和，未去壳种子吸水率已达到63.40%，表明女贞种子果皮具有一定的透水性。

2.3 种壳对女贞种子萌发的影响

造成种子休眠的原因之一是机械压迫，即种子外坚硬的种皮(果皮)或胚乳紧紧包裹种胚，以至于胚在萌发时胚芽或胚根生长力不足以穿透其束缚而造成休眠，因此种子萌发与否取决于种胚的穿透力和机械压迫力之间的比值。

女贞种子离体培养结果表明，剥去全部胚乳的离体胚置床培养1周后胚根端先变绿生长，2周后子叶开始生长，萌发率达到99%；露出1/2胚根的处理在前期胚根开始膨大，第2周胚根弯曲生长，而包被在胚乳中的子叶却无生长现象，后期胚根停止生长，种子霉烂；露出1/2子叶的离体胚培养1周后子叶开始变绿，2周后子叶展开，但直至第4周胚根仍无生长迹象；保留完整胚乳的种胚置床1周后均无胚根或子叶露出，后期陆续发霉腐烂。这说明女贞种胚不具备休眠性，去掉种壳后的种子不能顺利萌发，坚硬的胚乳影响了水和氧气的透性，因此，胚乳可能是限制女贞种子萌发的原因之一。

2.4 女贞种子内果皮、胚乳浸提液对白菜籽萌发率的影响

种子内含有内源抑制物质是导致种子休眠的一个重要原因，种子不同部位的浸提液对白菜籽发芽率影响的研究是测定内源抑制物质的快速而行之有效的方法。女贞种子内果皮、胚乳甲醇浸提液对白菜籽发芽率的影响如图3所示，女贞种子内果皮和胚乳浸提液在一定程度上抑制了白菜种子的萌发，且不同部位浸提液处理白菜种子的发芽率随着浸提液浓度的增大而降低，不同浓度的内果皮甲醇提取液处理的白菜籽发芽率分别比对照降低了2.75%、6.05%、9.83%、16.19%、21.97%；不同浓度的胚乳甲醇提取液处理的白菜籽发芽率分别比对照降低了9.64%、19.07%、26.69%、30.43%、42.65%，各处理与对照之间均差异极显著(<0.01)。从不同部位浸提液对白菜籽发芽率的影响来看胚乳的抑制效果大于内果皮，方差分析结果表明，除60%内果皮浸提液和20%胚乳浸提液差异不显著外，其他各处理间差异均极显著(<0.01)。

2.5 不同处理对女贞种子萌发的影响

2.5.1 HSO、NaOH溶液处理 由表1可以看出，经体积分数为98%的HSO溶液浸种处理10、20、30、40、50 min 的发芽率分别为35.30%、60.49%、88.59%、71.19%、67.48%，均高于对照，且各处理间差异极显著(<0.01)；在10～30 min范围内随着处理时间的延长，发芽率呈上升趋势；从30～50 min 范围内随着处理时间的延长，发芽率呈下降趋势。由表1还可以看出，女贞种子的发芽势与发芽率变化趋势一致，表明在30 min时女贞种子的发芽率高而且发芽集中(发芽势最高)，因此，女贞种子用浓硫酸浸种处理的最佳时间为 30 min 左右。

表1 H2SO4溶液处理对女贞种子发芽特性的影响

NaOH溶液处理结果(表2)显示，0.3 mol/L NaOH溶液处理女贞种子，在6～24 h范围内种子的发芽率和发芽势均随处理时间的增加而不断增加，各处理间差异达极显著水平(<0.01)；处理24 h后，种子的发芽率和发芽势分别达85.07%、82.48%，处理效果最好；处理36 h后种子的发芽率和发芽势分别达到了84.10%、74.27%，处理效果仅次于处理24 h，且二者之间的发芽率差异不显著，但二者之间的发芽势差异极显著(<0.01)。究其原因在于，短时间的NaOH溶液处理时，其腐蚀性可软化内果皮，提高种子的透水性和透气性，促进种子萌发；而长时间处理时种子内的蛋白质活性降低，种子萌发受到抑制。

表2 NaOH溶液处理对女贞种子发芽特性的影响

2.5.2 浸种处理 浸种对女贞种子发芽率的影响结果(图4)表明，在浸泡4～10 h种子的发芽率随水温的增加呈先升后降的趋势，大体表现为在20～50 ℃范围内，随着浸种水温的增加，种子的发芽率逐渐上升，在50 ℃时达到最高值；12～16 h随着水温的增加种子的发芽率逐渐降低，且各温度处理间差异极显著(<0.01)。女贞果实为核果，内果皮坚硬致密，未浸泡处理的女贞种子的发芽率仅为32.33%，经浸种处理的种子的发芽率均高于CK。因此，水温在20～50 ℃范围内浸种女贞种子的发芽率最高。不同浸种时间种子发芽率亦有不同，20 ℃浸泡12 h时发芽率最高，达84.67%；其次是50 ℃浸泡 8 h 和35 ℃浸泡10 h处理，其发芽率分别为83.33%、82.67%，二者无显著差异。65 ℃浸泡12、16 h处理的发芽率较低，均低于50%，分别为48.67%和45.44%；65 ℃浸泡10 h和50 ℃浸泡 16 h 处理的种子发芽率均低于60%，分别为51.33%、53.72%。

女贞种子的发芽率受水温和浸泡时间的双重影响，在适宜的浸种温度下，随着水温的增加，浸种时间会相应缩短，可见浸种处理可以软化内果皮，去除种子表面蜡质、提高透性并浸出种子内的抑制物质，从而提高种子萌发率。因此本试验的结果表明，女贞密实的内果皮是阻碍种子萌发的重要因素。

2.5.3 低温层积对种子萌发的影响 由图5可知，低温层积时间的长短对女贞种子发芽率有很大的影响。在4 ℃处理条件下，种子累计发芽率随着层积天数的增加先升高后下降，层积50 d种子的发芽率最高，种子累计发芽率达85.88%，比对照提高20.66%，层积效果最好，其后依次为层积30 d、层积70 d、CK、层积90 d，各温度处理间差异极显著(<0.01)。层积处理90 d时累计发芽率仅为64.91%，发芽率极显著(<0.01)低于对照，比对照提高8.56%。这一变化规律与蔡丹红等的研究结果一致。

3 讨论与结论

种子休眠指具有生活力的种子停留在不能发芽的状态的一种现象，种子休眠是植物形成的抵御不良环境的一种适应能力，种胚引起的体眠可分为胚的影响、种皮(果皮)影响和抑制物质影响。

有些种子外部形态发育成熟且已具有成熟种子的特征，但生理上必须经过一定阶段的发育，才能完成其内部的生理生化过程。如李铁华等发现引起钟萼木()种子休眠的主要原因是种子内缺乏萌发促进物质和酶活性低，用赤霉素溶液浸种或层积可解除种子休眠；刘继生等的研究表明，人参()种子成熟时其胚未发育完全，层积初期需提高温度促进胚的生长与分化，层积后期需降低温度促进种胚的生理生化过程。本试验中女贞种子种胚形态结构发育完全，离体胚培养结果表明，女贞种子种胚在去除种皮和胚乳后能在25 ℃恒温箱内顺利萌发，可见女贞种胚不存在休眠。

种胚外面包裹坚硬致密的包裹物质会导致种子的物理体眠，这些包裹物质可能是种皮(果皮)或胚乳，有些种子种皮(果皮)表面含有蜡质、黏质或革质物质，影响了种胚的透水性和透气性，进而影响种子内有氧代谢和种胚的营养供给，并对种胚胚根和胚芽的生长造成机械约束，有些硬实种子则是坚硬的种皮(果皮)对种胚胚根和胚芽的生长造成机械约束。如冯毓琴等发现，天蓝苜蓿()种子成熟时胚已发育成熟，硬实种子存在种皮抑制现象，导致种子很难吸水膨胀且种胚伸长受阻；坚硬致密的胚乳也是影响种胚生长的因素之一，王宏迪研究发现，黄精()属于综合休眠，其密实坚硬的胚乳细胞阻碍水分和空气进入种胚内部而导致休眠。通过女贞透水性试验和离体胚试验可知，女贞未去壳种子吸水率低于去壳种子，但在饱和吸水期未去壳种子的吸水量达63.40%，表明女贞内果皮虽相对坚硬致密，可能对种子萌发具有一定的影响但这不是女贞种子休眠的主要原因，本研究发现20 ℃浸泡12 h、50 ℃浸泡8 h和35 ℃浸泡10 h均可打破种子休眠，提高女贞种子的发芽率。有研究表明，HSO和NaOH溶液处理可腐蚀内果皮，打破胚乳的屏障，提高种子的透气性，如杜小芳等发现，甘草()、苦豆子()和苦马豆()种子属种皮障碍引起的物理性休眠，磨破、切割种皮以及利用浓硫酸破坏种皮致密组织等措施均能减弱机械障碍，促进种子萌发。本研究用体积分数为98%的HSO溶液浸种处理10、20、30、40、50 min的发芽率与对照相比均显著提高，其中30 min处理的发芽率最高；0.3 mol/L NaOH溶液处理也可显著提高女贞种子的发芽率，24 h处理效果最好，表明女贞种子坚硬的内果皮和胚乳的机械束缚是阻碍种子萌发的根本性限制因子。

种子或果实内存在的内源抑制物也会导致种子休眠，如禾本科(Gramineae)、樟科(Lauraceae)、兰科(Orchidaceae)、木兰科(Magnoliaceae)和瑞香科(Thymelaeace)植物等都属这一类。本研究中女贞种子不同部位内源性抑制物的提取液对白菜籽发芽抑制测定结果表明，女贞种子内果皮和胚乳中存在发芽抑制物质，说明种子内含有抑制物质可能是导致女贞种子休眠的另一个主要原因。关于这一猜测目前尚未见报道，有必要深入展开相关研究。