微纳米气泡对池塘微生态系统的调节作用

郑 晋，王亚迪，周润龙，李雪玲，吕军鸿，胡 钧

(1.中国科学院上海应用物理研究所，上海 201800；2.中国科学院大学，北京 100049;3.滨州医学院药学院 山东烟台 264003；4.纳米技术及应用国家工程研究中心，上海 201318；5.中国科学院上海高等研究院，上海 201203)

近年来微纳米气泡被应用在水体消毒、有机污染物降解和固体表面净化等多个领域[1-2]。微纳米气泡处理水体后具有副产物更少、安全性更高等特性，因此，在污水处理方面具有独特的优势[3]。微纳米气泡的水体净化能力通常是因为自身崩溃产生自由基或者是增加气体传输[3-5]，但其作用机制尚未完全清楚。

微生物在水生生态系统的化学循环中起着重要的作用，它可以分解并转化水体中的有机物或无机物[6]。此外，随着水质的变动和环境的影响，微生物群落的结构也会发生显著变化[7]。因此，微生物可以用来监测和评价水体污染[8]。最近，有许多研究发现了微纳米气泡对水系统中微生物群落的调节能力。例如，Nghia等[9]发现微纳米气泡处理可以通过控制副溶血性弧菌的水平来改善水质；Zhang等[10]以枯草芽孢杆菌为模型微生物研究了臭氧微米气泡技术的消毒性能；Wu等[11]研究表明微纳米气泡可以影响污染水中的微生物群落，从而进一步调节水的理化特性并持续减轻水污染。尽管人们认识到微纳米气泡能够影响微生物的活性，但是对微纳米气泡处理对水体微生态(微生物群体的结构、功能及其相互作用关系)的调节作用的了解仍然有限。而近年来宏基因组学的发展，使得其成为研究微生物群落结构和功能的重要工具。

宏基因组学是指利用基因组学策略研究特定环境样品中所含所有微生物的遗传组成和群落功能的方法[12]。这种方法可以避免微生物的分离和培养、进行微生物组成和微生物种群的相互作用研究，并在分子水平上研究其代谢途径和基因功能[13]。因此，为了进一步探究微纳米气泡净化水体的作用机制，本研究采用宏基因组学方法研究了微纳米气泡处理前后对池塘水体中微生物群落的组成和功能基因表达的影响。

1 试验材料和方法

1.1 水域的微纳米气泡处理及水体样品采集

试验于2018年秋季(8月28日—9月6日)在中国上海应用物理所内池塘进行，水温测量为29.8～30.5 ℃，同期平均气温为28.0～34.0 ℃。利用微纳米气泡曝气系统(图1)向池塘水体中通入微纳米气泡，微纳米气泡曝气系统由水箱、离心泵、控制阀、压力计、空气流量计和连接管道组成。在连续通过微纳米气泡18 d后(水质检测结果显示有明显改善)，分别在曝气点附近的3个位置取样，共取9个水体样本，以远离曝气点的池塘边缘样品做对照。采样瓶浸入水面下20～50 cm，每次取水样1 L，及时使用水体抽滤机抽滤，回收滤膜上的覆盖物抽提其总DNA，并对其进行质量检测评估。DNA样本检测合格后，将其随机片段化并筛选合适大小的插入片段进行文库构建。构建好的文库质检合格并精确定量后，上机进行Illumina HiSeq宏基因组测序。

图1 微纳米气泡调节池塘水体中微生物群落示意图Fig.1 Scheme of Micro-Nano Bubbles for Effecting the Microbiome in Pond Water

1.2 数据分析

对测序得到的原始数据(raw data)进行过滤处理，去除污染及低质量数据、清除污染序列等，得到有效数据(clean data)，以保证后续信息分析结果的准确可靠。从各样本质控后的有效数据出发，进行数据拼接组装，并统计组装结果。对重叠群(contigs)进行基因预测并去冗余，构建基因目录(gene catalogue)，然后获得各基因在各样本中的丰度信息。随后和MicroNR库进行比对，获得物种注释信息，并结合基因丰度表，获得不同分类层级的物种丰度表。最后进行代谢通路(KEGG)和同源基因簇(eggNOG)的功能注释和丰度分析，获得不同层级的功能丰度表。

2 结果和讨论

2.1 测序结果和处理

样品测序后的原始数据中重复序列比例、GC含量(DNA双链中GC碱基对所占的数量百分比)、读长(reads)平均长度以及读长数统计结果如表1所示。为确保所有样品的测序质量，本研究去除了模糊碱基(N)数超过阈值的读长。由于样本来源于自然界水体，不需要去除宿主序列。测序采用的是双端测序，每个样品得到2组读长数据，经筛选后第1 d采集的水体样品(D1)的2个方向均保留了32 013 061个高质量的读长，平均长度分别为147 bp和138 bp；第18 d采集的水体样品(D18)的2个方向均保留了35 873 340个高质量的读长，平均长度均为146 bp(表2)。通过过滤后的序列质量分布图可以看出，绝大多数的序列碱基质量都属于高质量部分。将通过质控的序列数据进行宏基因组组装以及开放阅读框架(ORF)预测操作，样品D1、D18分别共得到716 311、386 383个基因数目。将所有样品中预测出来的基因进行聚类(95%一致性、90%覆盖度)，每个类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集，所有的样品共得到962 170个非冗余基因。使用各样本有效数据比对到微生物参照标记基因(reference marker gene)数据库并利用mataphlan2获得各个样本在不同分类水平物种丰度信息。由于远离曝气点的对照点处理前后没有发现明显变化，下文只报告曝气点附近的样品在处理后微生态的变化情况。

表1 不同样品中测序结果Tab.1 Sequencing Results in Different Samples

表2 质检后宏基因组组装以及开放阅读框架预测结果Tab.2 Metagenomic Assembly and ORFs Prediction after Sequencing Data Filtering

2.2 水体中微生物群落的组成与多样性

为了剖析样品中微生物群落的组成的变化，绘制了Venn图[图2(a)]，结果显示在种水平上由第1 d的46种减少到第18 d的30种，其中22种没有发生改变。此外，对门水平上相对丰度变化分析发现，2个样品的前3个优势菌门均是蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)[图2(b)]。然而，第一优势门在第1 d为蓝藻门(其丰度为72.8%)，在第18 d则变为放线菌门。经过微纳米气泡处理后，蓝藻门和变形菌门丰度均有显著下降，其降低率在50%左右；而放线菌门丰度(phylum abundance)则显著提高，由14.84%(第1 d)提高到57.61%(第18 d)[图2(b)～图2(c)]。

为了反映各样本物种多样性差异，计算了各样本中基于物种的香农(Shannon)指数。结果表明，经过微纳米气泡处理后，水体中的香农指数由第1 d的3.24下降到第18 d的3.07，而对照点样品没有变化。这也表明经过微纳米气泡处理会在一定程度上降低水体中微生物群落的物种多样性。

研究发现微纳米气泡的气穴现象能够使得大肠杆菌增殖效率在3 min内降低75%[14]。此外，也有几项研究报道了类似的微纳米气泡技术产生的水动力空化效应对水消毒的有效性[14-15]，其中破溃的微纳米气泡引起的冲击波被认为是大肠杆菌失活的主要原因。蓝藻和变形菌均是革兰氏染色阴性菌，细胞壁较为脆弱；而放线菌是革兰氏阳性菌，细胞壁较为坚韧。因此，推测微纳米气泡破裂产生的气穴效应使得蓝藻和变形菌相较于放线菌更容易失活消亡，从而造成微纳米气泡处理前后水中菌落的组成差异，造成水体中菌体群落多样性的降低。

蓝藻群落的多样性和丰度会对淡水水质的变化做出反应，并可在环境研究中用于河流系统的水体质量评估[16]。此外，由于蓝藻会产生有腥臭味的“水华”(又称“藻华”)现象，还会分泌毒素令饮用水源的安全性受到威胁，也会盖住水池令鱼类缺氧死亡，进一步造成水体污染[17-19]。在本研究中，蓝藻丰度的降低也证明了微纳米气泡有助于水质的恢复[图2(b)～图2(c)]。据报道，变形菌具有巨大的代谢多样性和硫氧化、硝酸盐还原和反硝化的能力，因此，在水生生态系统中的氮、硫代谢中起着重要作用[20-21]。本研究发现，微纳米气泡处理后变形菌的丰度显著降低，可能意味着池塘水体系统的氮硫循环水平降低。总之，微纳米气泡通过影响池塘水中微生物群落的组成和多样性来调节水体生态系统。

注：X轴代表门水平的相对丰度变化，右侧显示增加的微生物，左侧显示减少的微生物；门丰度变化率=[(A18-A1)/A1]×100%，“A1”指第1 d微生物的门丰度，“A18”指第18 d微生物的门丰度图2 微纳米气泡处理后池塘水体微生物群落的组成演变Fig.2 Composition Evolution of Microbial Communities in Pond Water Body after Micro-Nano Bubble Treatment

2.3 功能基因及代谢通路丰度差异

使用BlastX软件，将拼接得到的所有核苷酸序列分别与String、Swissprot和KEGG数据库进行比对，获得相应的注释信息。GO二级注释结果(图3)结果表明，经过微纳米气泡处理后微生物群落中运货受体活性(cargo receptor activity)基因占比明显降低，营养库活性(nutrient reservoir activity)基因活性几乎消失，而其他的功能基因占比没有明显差异。此外，还选取了KEGG注释中包含基因或转录本数目最多的前20个通路进行分析(图4)，可以看出ABC转运器(ABC transporters)通路和双组分系统(two-component system)通路在D18样品中相较于D1样品中活跃度明显降低，而嘌呤代谢(Purine metabolism)通路在D18样品中更为活跃。

注：横坐标表示GO的二级分类术语，左边纵坐标表示包含在该二级分类中的基因占总数的百分比，依据不同功能将基因分为3组：生物学过程、细胞组成及分子功能图3 微纳米气泡处理前后池塘水体中微生物基因功能的GO注释结果统计Fig.3 Gene Abundance of Microbial Communities in Pond Water before and after Micro-Nano Bubble Treatment Based on GO Annotation

注：其中包含基因数目最多的前20个通路；从左至右按照所包含的基因数目从高到低依次排列，柱子越高表明该生物学通路在样本中越活跃图4 微纳米气泡处理前后池塘水体中微生物基因功能的KEGG注释结果Fig.4 Gene Abundance of Microbial Communities in Pond Water before and after Micro-Nano Bubble Treatment Based on KEGG Annotation

运货受体活性基因具有与货物(cargo)特异性结合以将其递送至运输囊泡的功能。营养库活性基因水平下降意味着储存营养基质功能降低，反映了水体中有机成分的减少。ABC转运器是一类在原核及真核生物中都广泛分布的膜蛋白超家族，其利用ATP水解产生的能量将底物进行跨膜运输，从而参与营养摄入、细胞解毒、脂质稳态、信号转导等多种重要的生理过程。双组分系统是存在于细菌内的一种信号传导系统，是细菌适应选择压力的一种机制。嘌呤在生物体的能量供应、代谢调节及组成辅酶等方面起着十分重要的作用。上述功能基因及代谢通路丰度变化结果显示，微细气泡处理影响细胞跨膜运输、信号传导及嘌呤代谢等功能。

3 结论

(1)在本研究中，利用宏基因组学方法分析了微纳米气泡在池塘水处理过程中对微生物群落的生物学效应。研究发现，纳米气泡处理可以降低变形菌和蓝藻等微生物的相对丰度，并促进放线菌门等微生物的生长，改变了水体微生物种群的多样性，进而调节了池塘水体微生物菌落的平衡。

(2)变形菌门微生物对于水体的氮、硫代谢发挥重要作用，而放线菌门微生物在富含有机质的水体中比较活跃，因此，微纳米气泡处理后，水体中变形菌门和放线菌门微生物丰度的演变可能意味着水体从氮、硫循环旺盛的体系演化为有机质代谢旺盛的体系。此外，水体中蓝藻丰度的降低进一步表明微纳米气泡促进了水体的修复。

(3)纳米气泡处理可以调节池塘水体中微生物运货受体活性基因和营养库活性基因占比以及ABC转运器、双组分系统和嘌呤代谢等代谢通路，进而调整池塘微生物群落的生物学功能，最终有利于水质的优化。

(4)本研究发现，调节水体中微生物群落结构及基因功能的平衡、维持其稳定性可能是微纳米气泡在水处理中的潜在作用机制，为理解微纳米气泡效应提供了新的视角。