外排泵在肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星耐药中的作用*

江培涛，吴 钧，方 敏，马 超，李琛泽

1.南京鼓楼医院集团仪征医院/扬州大学医学院附属医院检验科，江苏扬州 211900；2.南京医科大学附属脑科医院检验科，江苏南京 210029

肺炎克雷伯菌(KP)是临床常见的革兰阴性条件致病菌，可以引起呼吸道、尿道、血流等多种感染性疾病。除头孢菌素等β-内酰胺类抗菌药物之外，左氧氟沙星(LVX)等氟喹诺酮类抗菌药物因为具有口服吸收好、生物利用度高、不良反应少等优点，也常常作为成年人KP感染的治疗选择。但是，近年来KP引起的医院感染及其耐药率逐年增高，尤其是以耐碳青霉烯类药物为代表的多重耐药KP感染的不断增加，常常导致抗菌治疗失败、住院时间延长、治疗费用增加，甚至病死率增高等不良后果，因而如何治疗多重耐药KP感染逐渐成为临床医师面临的难题。外排泵系统的高度表达是KP获得多重耐药的机制之一，其中属于耐药结节分化(RND)家族的AcrAB-TolC外排泵在肠杆菌科中检出率最高[1]。由外排泵介导的KP对碳青霉烯类、替加环素等抗菌药物的耐药机制研究已屡见不鲜，而外排泵介导KP对喹诺酮类耐药机制报道相对较少。本研究拟探讨外排泵OqxAB、AcrAB和QepA在KP临床菌株中的基因表达情况及其在KP对LVX耐药中的作用，以期为临床预防和控制多重耐药KP感染提供更多理论参考。

1 材料与方法

1.1菌株来源 106株KP分离自江苏省仪征市南京鼓楼医院集团仪征医院2018年7月至2020年12月的门诊和住院患者，已剔除同一患者相同部位的重复分离株。标本来源：重症监护病房24株，呼吸内科31株，神经外科20株，胸外科13株，儿科6株，其他科室12株；标本类型：痰及肺泡灌洗液74株，尿液18株，脓液及伤口分泌物7株，血液4株，导管3株。质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC 25922、KP ATCC 700603，均购自生物梅里埃公司。

1.2主要仪器与试剂 GHP-9270数显隔水式恒温孵育箱(上海精宏医疗器械厂)；MicroScan WalkAway 96 Plus 细菌鉴定药敏分析仪(美国贝克曼公司)；TGL-18R冷冻高速离心机(珠海Hema医学仪器公司)；NanoDrop2000分光光度计(美国Thermo公司)；ABI7500PCR仪(美国ABI公司)；LVX注射液(浙江医药股份有限公司)；LB肉汤(杭州百思生物技术公司)；水解酪蛋白(MH)琼脂(杭州滨河生物技术公司)；细菌基因组实时定量反转录PCR(qRT-PCR)试剂盒(北京天根生化科技公司)；琼脂糖(广州赛国生物科技公司)。

1.3菌株鉴定和药物敏感试验(简称药敏试验) 所有菌株的分离培养均严格按照《全国临床检验操作规程》第4版操作，菌种鉴定和LVX等常规药敏试验(微量肉汤稀释法)均由MicroScan WalkAway 96 Plus系统完成。所有菌株的鉴定均通过PCR检测rpoB基因进行确认。药敏试验判断标准参照2018版临床实验室标准化协会(CLSI)M100[2]执行，以LVX的最低抑菌浓度(MIC)≤2.00 μg/mL为敏感，MIC=4.00 μg/mL为中介，MIC≥8.00 μg/mL为耐药。随机选取24株对LVX耐药的KP作为试验组，另随机选取27株对LVX非耐药的KP(25株敏感，2株中介)作为对照组进行后续试验。

1.4KP的外排泵表型测定 参照文献[3-4]以KP ATCC700603标准株生长良好的羰基氰氯苯腙(CCCP)溶液水平25 μg/mL为外排泵抑制剂工作水平；采用微量肉汤稀释法分别测定加入CCCP前后LVX对两组KP的MIC，同时以不含药物的肉汤作为生长对照。本试验以加入外排泵抑制剂后LVX的MIC值降低至原值的1/4或更低作为外排泵表型阳性的判定标准。

1.5外排泵基因检测 采用qRT-PCR检测外排泵OqxAB、AcrAB和QepA相应表达基因OqxA、acrB和QepA的表达水平。用阳离子调节的MH肉汤稀释的隔夜细菌培养物在35 ℃下生长至对数阶段，摇动混匀(200 r/min)。在无RNase的环境中，用Trizol法从分离物中提取总RNA。测定RNA的产量和质量，然后将RNA水平调整到150 ng/mL。使用反转录试剂盒将所有分离物的总RNA反转录成cDNA；然后用qRT-PCR(60 ℃ 30 s；50 ℃ 5 min；95 ℃ 10 min；40次循环95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min；60 ℃ 30 s)对靶基因的相对表达量进行测定。以KP ATCC700603作为参考菌株(表达水平=1)，用2-ΔΔCt方法根据管家基因rrsE(KP)的表达计算被测基因的相对表达量，所有标本3复孔测定，取平均值。用于上述基因检测的引物(表1)合成及上述试验由南京祖和生物技术公司完成。

1.6acrR基因突变检测 对LVX耐药KP临床分离株，用表1所述引物进行PCR并测序，以证实acrR中相对于参考KP株MGH78578(CP000647)[5]的突变存在。

表1 相关基因引物序列和产物长度

1.7统计学处理 用Whonet5.6软件进行抗菌药物敏感性统计；用SPSS20.0软件通过t检验分析两组之间基因表达水平的差异；用线性回归分析MIC与基因表达水平之间的关系；采用χ2或Fisher确切概率法分析两组之间外排泵表型的差异。以P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1药敏试验及菌株确认试验结果 106株KP对LVX的敏感率为69.8%(74/106)，中介率为3.8%(4/106)，耐药率为26.4%(28/106)，见表2。rpoB基因PCR电泳结果显示，随机选取的51株菌株均为KP，见图1。

表2 106株KP对常用抗菌药物的药敏试验结果[%(n)]

注：试验组01～24分别对应菌株号为LVX-R2、LVX-R7、LVX-R11、LVX-R15、LVX-R26、LVX-R32、LVX-R39、LVX-R42、LVX-R53、LVX-R67、LVX-R69、LVX-R71、LVX-R72、LVX-R74、LVX-R77、LVX-R79、LVX-R89、LVX-R94、LVX-R96、LVX-R97、LVX-R100、LVX-R106、LVX-R108、LVX-R111的KP；对照组01～27分别对应菌株号为LVX-S66、LVX-S68、LVX-S70、LVX-S75、LVX-S76、LVX-S78、LVX-S80、LVX-S81、LVX-S82、LVX-S83、LVX-S84、LVX-S85、LVX-S86、LVX-S87、LVX-S88、LVX-S90、LVX-S91、LVX-S92、LVX-S93、LVX-S95、LVX-S98、LVX-S99、LVX-S101、LVX-S102、LVX-S113、LVX-S62、LVX-S103的KP。M为DNA Marker，条带大小从上至下依次为1 000、700、500、400、300、200、100 bp。

2.2外排泵表型试验结果 随机选择的51株KP中，9株外排泵表型试验结果为阳性(17.6%)。参照CLSI M100(S28)标准，试验组中有3株KP表现为外排泵表型试验阳性，其中2株对LVX耐药逆转为敏感；对照组中有6株KP表现为外排泵表型试验阳性，其中2株对LVX中介的菌株均表现为外排泵表型试验阳性，且均逆转为敏感，25株对LVX敏感的菌株中有4株表现为外排泵表型试验阳性。试验组、对照组外排泵表型试验结果差异无统计学意义(χ2=0.293,P>0.05)。见表3。

表3 两组KP临床分离株外排泵表型试验结果

2.3qRT-PCR结果 两组KP外排泵基因OqxA、QepA表达水平差异无统计学意义(t=0.651、-0.669，P=0.518、0.506，图2A、2B)，而acrB表达水平差异有统计学意义(t=12.76，P<0.001，图2C)，且试验组acrB表达水平与LVX的log2MIC呈正相关(r=0.544，P=0.006，图2D)。

注：A、B、C分别为两组KP外排泵基因OqxA、QepA、acrB表达水平比较；D为外排泵基因acrB表达水平与log2 MIC间关系散点图。。

2.4acrR基因突变检测 试验组acrR基因PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳及测序结果显示菌株02(LVX-R7)、03(LVX-R11)、05(LVX-R26)、07(LVX-R39)、11(LVX-R69)、12(LVX-R71)、18(LVX-R94)、21(LVX-R100)、23(LVX-R108)、24(LVX-R111)扩增出969 bp大小(野生型)的目的片段，而其余14株(58.3%)均扩增出2 000 bp大小(突变型)的条带(图3)。经测序比对，两种产物与美国生物信息中心基因库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中KP株MGH78578序列一致性达到98%以上。突变型菌株序列改变主要为碱基置换(图4、5)。10株携带野生型acrR基因的菌株与14株携带突变型acrR基因的菌株acrB基因表达水平差异无统计学意义(t′=0.993，P=0.347)。

注：01～24分别对应试验组菌株号为LVX-R2、LVX-R7、LVX-R11、LVX-R15、LVX-R26、LVX-R32、LVX-R39、LVX-R42、LVX-R53、LVX-R67、LVX-R69、LVX-R71、LVX-R72、LVX-R74、LVX-R77、LVX-R79、LVX-R89、LVX-R94、LVX-R96、LVX-R97、LVX-R100、LVX-R106、LVX-R108、LVX-R111的KP；M为DNA Marker。

图4 试验组部分突变型菌株acrR基因正向测序峰图

图5 试验组部分突变型菌株acrR基因碱基序列比对图

3 讨 论

KP是临床常见的条件致病菌，2019年CHINET三级医院数据表明，其在临床标本中的检出率为15.17%，仅次于大肠埃希氏菌，且该菌对碳青霉烯类的耐药率呈持续上升趋势，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2005年的3.0%、2.9%上升至2019年的25.3%、26.8%，对环丙沙星耐药率从2005年的41.0%逐年下降至2014年的22.4%后又回升至2019年的38.1%，对LVX的耐药率从2017年的26.6%上升至2019年的33.4%[10]。本研究中106株KP对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为23.6%和25.5%，对环丙沙星和LVX的耐药率为分别为27.4%和26.4%，均低于全国水平。分析差异产生的原因，可能与南京鼓楼医院集团仪征医院收治病种及抗菌药物可选种类与三级医院不同有关，后者收治患者病情相对复杂，医院获得性感染及多重耐药菌感染常见，抗菌药物选择压力大，导致多种抗菌药物的耐药率较高。

LVX属于第3代喹诺酮类抗菌药物，一般用于治疗成人呼吸道、泌尿生殖道和皮肤软组织等感染，该药具有广谱抗菌作用，对多数肠杆菌目细菌、革兰阳性菌、肺炎支原体和衣原体有抗菌作用。本研究表明LVX体外抗菌活性强于第2代喹诺酮类抗菌药物环丙沙星，这与全国数据一致[10]。LVX主要作用机制是通过抑制细菌DNA解旋酶的活性，阻止细菌DNA的合成而导致菌体死亡。

研究表明，KP对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药机制除了DNA解旋酶和拓扑异构酶突变之外，质粒介导耐药、外膜通透性下降以及外排泵因素都有作用[1,11-12]。AcrAB-TolC外排泵系统广泛分布于革兰阴性菌中，属于RND超家族，以质子驱动力为能量，通过外排泵将进入菌体内的药物或对自身有害的物质排出体外[1]。同时文献[4,13]报道，KP AcrAB-TolC外排泵可能与其毒力有关，该外排泵主要由膜融合蛋白(AcrA)、外排转运蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)3部分组成。有关外排泵介导KP耐药多见于KP对碳青霉烯类、替加环素等限制使用级抗菌药物耐药的报道中[8,13-14]，但有关外排泵介导KP对LVX耐药性与外排转运蛋白相关基因表达水平和调节因子变异之间关系的研究尚不多见。本研究显示，对LVX耐药的24株KP(试验组)中，有3株表现为外排泵表型试验阳性，其中2株对LVX耐药逆转为敏感；对LVX非耐药的27株KP(对照组)中，6株表现为外排泵表型试验阳性，其中2株对LVX耐药逆转为敏感，但两组的外排泵表型试验结果差异无统计学意义(P>0.05)，这说明外排泵可能广泛流行于KP中，但本研究样本量小，其真实差异有待进一步研究。值得一提的是，本研究是一项回顾性分析，2019年CLSI将肠杆菌目LVX的敏感性折点修订至MIC≤0.5 μg/mL，若以此为标准则外排泵表型阳性菌株均集中在对LVX耐药和中介的菌株中，且中介菌株全部表现为外排泵表型阳性并可逆转为对LVX敏感。该结果说明外排泵在KP对LVX的耐药机制中起到一定作用。本研究进一步分析了KP 3种外排泵转运蛋白相关基因OqxA、QepA和acrB表达水平与LVX MIC的关系，结果显示OqxA、QepA表达水平与MIC的升高并无相关性，这与文献[8]报道相近。但试验组与对照组的acrB表达水平差异有统计学意义(t=12.76，P<0.001)，且acrB表达水平与LVX的log2MIC呈正相关(r=0.544，P=0.006)，说明AcrAB外排系统可能是介导KP耐药的一个重要机制。需要指出的是，本研究中OqxA在对LVX敏感的KP中的表达水平高于对LVX耐药的KP，这与翟俊斌[15]等关于对碳青霉烯类耐药的KP的研究一致。类似的研究结果表明OqxAB外排系统虽广泛分布于KP中，但并不是介导KP对LVX、碳青霉烯类等抗菌药物耐药的机制，这与以往的报道不同[16-17]，其机制和原因有待深入研究。

研究表明，AcrAB-TolC外排泵的调控体系中，整体调控因子MarA和RamA增加该泵的外排作用，局部调控因子acrR阻遏AcrAB的外排作用[18]。据此推断acrR的低表达或突变导致的外排阻遏功能缺失将会导致细菌耐药性增高，本研究分析了对LVX耐药的KP的局部调控因子acrR的突变现象，在24株耐药的KP中，有14株(58.3%)发生了acrR基因突变，突变的主要类型为碱基置换。但携带突变型acrR基因的KP(14株)的acrB基因表达水平并不显著高于携带野生型acrR基因的KP(10株)。因而推测acrR因子的阻遏调节在AcrAB-TolC外排泵介导的KP对LVX耐药中不占主导作用，在10株含野生型acrR基因的对LVX耐药的KP中，其他机制可能共同介导了该菌对LVX的耐药。本研究尚存在一定局限性，如样本量较小，还需积累样本量，对OqxA在对LVX敏感KP中的表达水平高于对LVX耐药KP的机制进一步研究。

综上所述，外排泵OqxAB、AcrAB和QepA虽然广泛流行于革兰阴性菌中，尤其是OqxAB在KP中广泛表达，但介导KP对LVX耐药的主要外排系统是AcrAB。