甘蓝与甘蓝型油菜杂交胚挽救技术研究

杨红丽，徐学忠，胡靖锋，兰 梅，张丽琴，和江明，宋 爽

（云南省农业科学院，a.园艺作物研究所；b.国家蔬菜改良中心云南分中心；c.离退休处，昆明 650205）

甘蓝（Brassica oleraceaL.）是中国重要的蔬菜作物，在全国各地均有栽培，甘蓝根肿病大面积的发生导致甘蓝品质和产量大幅度降低，给生产带来严重的经济损失，选育抗根肿病甘蓝品种是防治的重要途径之一。目前市场上用的抗根肿病甘蓝品种多为国外萝卜胞质雄性不育品种，对推广品种实行技术垄断，使产业发展受制于国外［1-3］。解决这一问题的有效方法是寻找和创制细胞质雄性不育的恢复系，目前，尚未发现在甘蓝类蔬菜中存在细胞质雄性不育恢复系，因此，迫切需要从其他作物中导入恢复基因，创制出甘蓝类蔬菜细胞质雄性不育恢复系，前人利用甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复系已经成功创制并用于杂交种生产［4］。

为了拓宽育种材料的遗传背景，许多学者将物种间的远缘杂交作为主要手段，对植物性状进行有目的的改良和优化。杂交的不亲和性及杂种的不育性是远缘杂交的两大瓶颈，常规人工杂交较难获得成功［5-9］。在十字花科作物中，前人利用胚挽救技术克服远缘杂交中幼胚死亡或败育的问题已取得显著成绩［10-15］。甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交时，采用常规的杂交方法无法克服杂种胚的败育得到杂交种，本研究通过胚挽救试验，在胚败育之前取材子房和胚株进行离体培养，最终获得杂合的离体培养植株，目的旨在利用含雄性不育恢复基因的甘蓝型油菜来恢复雄性不育甘蓝材料的育性。通过对甘蓝与甘蓝型油菜杂交后胚挽救培养取材时间与培养基配比的比较，筛选出甘蓝与甘蓝型油菜杂交后胚挽救的适宜取材时间和培养基，为提高杂种获得率，有益基因转移提供理论依据和实际应用技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蓝雄性不育系GL16047、甘蓝型油菜N18008均由云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组提供。

1.2 试验方法

试验方法参考扈新民等［16］在甘蓝与萝卜属间杂交及其胚挽救技术优化的试验方法，试验于2018年4 月在云南省农业科学院园艺作物研究所试验基地进行，甘蓝与油菜分别与其他作物隔离种植，常规栽培管理。以甘蓝雄性不育系GL16047 为母本、油菜自交系N18008 为父本配制属间杂交组合，蕾期套袋，人工授粉。在杂交前2~3 d 摘除父、母本花序上已开放的花朵，套袋隔离。授粉后套袋隔离，严格防止父本以外的花粉污染，杂交后分别取材进行子房培养和胚珠培养。

1.2.1 授粉后不同时间取样对离体子房发育的影响 分别取授粉后第5、6、7、8、9、10 天的子房，先用75%的乙醇消毒子房50~60 s 和10%次氯酸钠消毒15 min，然后再用无菌水冲洗3 次，冲洗后将子房浸泡于无菌水中3~5 min，最后接种在A4 培养基（MS+1.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/ L）上。每个处理接种10 个子房，重复3次，共接种180 个子房。接种子房的培养基置于温度（24±2）℃、光照度1 500 lx、每天光照12 h 的环境中培养，接种30 d 后剥出幼胚继续培养，最后统计出苗情况，隔15 d 更换一次培养基。

1.2.2 不同激素处理对离体子房发育的影响 取授粉后第8 天的子房，在超净工作台进行表面消毒（消毒方法同“1.2.1”），分别接种在以下培养基：A1 培养基（MS+0.6 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、A2 培养基（MS+0.8 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、A3培养基（MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、A4 培养基（MS+1.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）。每种培养基接种10 个子房，重复3 次，共接种120 个子房，接种30 d 后剥出幼胚继续培养，最后统计出苗情况，隔15 d 更换一次培养基。接种的培养基在培养过程中的光温条件同上。

1.2.3 授粉后不同取样时间对离体胚珠发育的影响 分别取授粉后第14、16、18、20、22、24 天的子房，在超净工作台进行表面消毒（消毒方法同“1.2.1”），无菌条件下在滤纸上用镊子和解剖刀剥离出胚珠，将发育正常色泽发亮的胚珠接种于B4 培养基（MS+7.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L），每个取样天数接种15 个胚珠，重复3 次，共接种270 个胚珠。接种的培养基在培养过程中的光温条件同上，接种30 d 后开始调查胚珠出胚情况。

1.2.4 不同激素处理对离体胚珠发育的影响 取授粉后20 d 的子房，在超净工作台进行表面消毒（消毒方法同“1.2.1”），无菌条件下在滤纸上用镊子和解剖刀剥离出胚珠，将发育正常色泽发亮的胚珠分别接种于以下培养基：B1 培养基（MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、B2培养基（MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、B3 培养基（MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）、B4 培 养 基（MS+7.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L）。每种培养基接种15 个胚珠，重复3 次，共接种180 个子房，接种的培养基在培养过程中的光温条件同上。

2 结果与分析

2.1 授粉后不同取样时间对离体子房发育的影响

从表1 可以看出，授粉后第5 天子房培养出胚率为0%，授粉后第6 天、第10 天子房培养出胚率相同，为3.3%，授粉后第7 天、9 天子房培养出胚率相同，为6.7%，授粉后第8 天子房培养出胚率为10.0%，授粉后第8 天的出胚率最高。试验结果表明，授粉后不同时间取样培养对杂种胚的发育影响很大，离体子房培养的取样时间不是越早越好，授粉后第5 天取样，子房生长量小，出胚率为0；授粉后第10 天取样，随授粉后天数的增加，子房生长量逐渐变小，杂种核和卵细胞的代谢不协调，出胚数降低；离体子房培养适宜的取样时间为授粉后第8 天，不同天数取样离体子房培养的出胚率差异明显。

表1 授粉后不同取样时间对离体子房发育的影响

2.2 不同激素处理对离体子房发育的影响

从表2 可以看出，取授粉后第8 天的子房接种，A1 培养基的出胚率为3.3%，A2、A4 培养基的出胚率为6.7%，A3 培养基的出胚率为10.0%。试验结果表明，在胚培养中，适宜的激素处理可提高杂种胚获得数，对离体子房的发育有明显的促进作用，1.0 mg/L 6-BA 对出胚有明显的促进作用，浓度过低（0.6~0.8 mg/L）出胚数少，浓度过高（1.2 mg/L）对出胚有抑制作用，出胚率降低。A3 培养基的出胚率最高，不同培养基之间的出胚率差异明显。

表2 不同激素处理对离体子房发育的影响

2.3 授粉后不同取样时间对离体胚珠发育的影响

从表3 可以看出，不同取样时期对胚珠出胚率有直接影响，授粉后第14 天胚珠培养出胚率为0，授粉后第16 天、第24 天胚珠培养出胚率相同，为2.2%，授粉后第18 天胚珠培养出胚率为11.1%，授粉后第20 天胚珠培养出胚率为15.5%，授粉后第22天胚珠培养出胚率为8.9%。试验结果表明，胚珠培养取样时间很重要，取样时间过早，种胚过小脱离母体后离体培养难度较大不容易存活，出胚率低；取样时间过迟，胚珠发育开始退化，出胚率降低，在胚珠发育到一定时期但未开始退化前取样，才能取得较好的效果；第20 天取样的出胚率最高，不同天数取样胚珠培养的出胚率差异明显。

表3 授粉后不同取样时间对离体胚珠发育的影响

图1 是GL16047×N18008 离体胚珠培养情况，A图是离体胚珠培养，成活胚增殖分化60 d 的生长情况；B 图是离体胚珠培养，增殖生长成幼苗90 d 的生长情况；C 图是离体胚珠培养，生长成独立植株，120天炼苗移栽的生长情况。

图1 GL16047×N18008 离体胚珠培养情况

2.4 不同激素处理对离体胚珠发育的影响

从表4 可以看出，取授粉后第20 天的子房进行离体胚珠培养，B1、B2、B3、B4 培养基上的出胚率分别为2.2%、6.7%、13.3%、0%，B3 培养基的出胚率最高；6-BA 浓度过高和过低都达不到理想的效果，只有适量才能达到最佳效果。试验结果表明，适宜胚珠培养的6-BA 浓度为5.0 mg/L，不同培养基之间的出胚率差异明显。

表4 不同激素处理对离体胚珠发育的影响

总的看来，甘蓝与甘蓝型油菜的杂交胚珠培养在杂种出胚率上明显优于子房培养，子房培养的杂种胚与胚珠培养的杂种胚发育存在差异，子房培养的杂种胚增殖慢，生长弱，不易得到再生植株，胚珠培养出的杂种胚增殖快，生长势强，容易获得再生植株。

3 小结与讨论

远缘杂交是对作物进行遗传改良的重要途径，胚挽救在十字花科植物远缘杂交中应用广泛。为恢复雄性不育甘蓝的育性，通过杂交，利用含恢复基因的甘蓝型油菜恢复雄性不育甘蓝的育性，使甘蓝和甘蓝型油菜的优良特性聚合，选育出高产、优质和抗根肿病的甘蓝新品种，满足生产需求。

十字花科作物中不同物种间胚挽救胚龄大小选择不同，胚龄大小对胚珠培养的影响最大，一般来说胚龄越小则要求的培养条件越复杂。在本试验胚珠培养中，胚珠培养最佳取样时间以授粉后第20 天为宜，过早或过晚取样胚珠出胚率降低，胚成活最短时间在授粉后第16 天，超过24 d 取样，胚珠发育开始退化，出胚率降低。究其原因，种胚过小脱离母体后离体培养难度较大不容易活，可能是雌雄配子的结合能力较差，远缘杂交种受精后期异源遗传物质的导入致使胚珠内遗传不协调，胚容易出现败育现象，这与扈新民等［16］甘蓝与萝卜属间杂交及其胚挽救技术优化的结论相似。

在本试验中，NAA、6-BA 两种激素使用对离体子房和胚珠的发育和形成起到很好的促进作用，子房培养其中以MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L 组合效果最好，胚珠培养以MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+活性炭1 000 mg/L 组合效果最好。

在本试验子房培养中，授粉后的离体时间对杂种胚的发育有很大影响，过早或过晚取样对出胚率都有影响。授粉后第5 天取样进行离体子房培养，子房生长量小，出胚数少，其原因可能是细胞分裂素和生长素提供适宜的营养环境及发育的光温条件可能会降低杂种核和卵细胞的这种代谢的不协调性；授粉后第10 天取样进行离体子房培养，出胚数减低，是由于随着授粉后天数的延长，杂种核和卵细胞的代谢不协调对杂种胚发育的影响增大所致，这与戴林建等［17］油菜与芸芥属间杂种离体子房和胚培养研究的结论一致。甘蓝与甘蓝型油菜种间杂种的获得为有益的基因交换和恢复雄性不育甘蓝的育性找到了途径。