辣木花部特征、花粉活力及柱头可授性分析

普天磊，韩学琴，廖承飞，罗会英，何 璐，邓红山，范建成，金 杰

（云南省农业科学院 热区生态农业研究所/元谋干热河谷植物园，云南 元谋 651300）

辣木（Moringa oleiferaLam.）为辣木科辣木属的多年生落叶乔木，共有13个种，生长速度快，种植6个月即可开花结果，产量高，适应性强，在热带、亚热带地区均可种植［1-2］。辣木全株富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等营养成分［3］，黄酮、多酚、多糖、异硫氰酸酯、生物碱、萜类等功效成分，既能有效地抵抗营养不良，又具有降血糖、降尿酸、抗肿瘤、调血脂、抗氧化、抗炎、保肝等药理作用［4-5］，是一种极具营养价值、药用价值和经济价值的植物。辣木于2012年被我国卫健委批准为新资源食品，现已广泛应用于食品、饲料、日化、净水等领域［6］。

繁育系统是种群有性生殖的纽带，一般通过花表型性状、花粉活力、柱头可授性、花粉胚珠比等参数评判［8-9］。花粉活力的测定方法分为2种：一种为染色法，即I2-KI染色法、氯化三苯四氮唑法（TTC法）、醋酸洋红染色法等；另一种为离体萌发法，离体培养法是能较好地反映花粉活力真实值的方法，柱头可授性一般采用联苯胺—过氧化氢法测定［10-11］。辣木原产于印度、肯尼亚、尼日利亚等国家，主要分布于我国的云南、海南、广东、福建等地［7］。我国栽培的辣木多从国外引进，国内辣木育种进展缓慢，优质品种匮乏，繁育类型分析对辣木遗传育种工作的开展具有重要意义。本研究通过对辣木花形态特征的观测以及花粉活力、柱头可授性的分析，以期为辣木杂交育种工作的开展提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来自云南省农业科学院热区生态农业研究所辣木创新基地（101.87°E，25.69°N，海拔1118.2 m），属于季风型干热河谷气候，常年平均气温21.9 ℃，年降水量低于700 mm。选取植株健壮，生长良好，产量较高的辣木材料，于早晨9:00花药散粉时，随机摘取不同开放状态的辣木花朵带回实验室，分离出花药与柱头，测定花粉活力和柱头可授性。

1.2 花部特征的观察和测量

分别取10朵不同开放状态的辣木花进行解剖，并采用游标卡尺依次测量花冠直径、花冠长度、萼片直径、萼片长度、雄蕊长度、雌蕊长度。

1.3 花粉活力的测定

添加300 μL的液体培养基于EP小管，培养基由175 g/L蔗糖、400 mg/L氯化钙及150 mg/L硼酸构成，分别取辣木不同开放状态的花药置于培养基中，每个状态重复3次，将花粉轻轻剥离并均匀分散于培养液，置于垫有湿润滤纸的培养皿中，避光条件下自然培养，用显微镜（江南永新BM2000）定时观察，花粉萌发率稳定后，随机选取5个不重复的视野，每个视野不少于150粒花粉粒，统计视野内的花粉萌发数和花粉总数，并计算花粉萌发率，根据花粉萌发率判断花粉活力的强弱，计算公式如下：辣木萌发率（%）=萌发的花粉数（粒）/总花粉数（粒）×100%。

1.4 柱头可授性的测定

取不同开放状态的辣木花朵柱头置于凹面载玻片上，滴加由1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22的比例配制而成的反应液至浸满柱头，迅速置于显微镜下观察柱头的反应状况，根据气泡产生的多少和快慢来判断柱头活性的强弱。

1.5 异交指数（OCI）的评判

依据 Dafni的标准评判辣木的繁育系统类型，具体如下：花朵直径＜1 mm记为0，1～2 mm记为1，2～6 mm记为2，＞6 mm记为3；花药开裂的同时柱头具有可授性或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1；柱头与花药在同一高度记为0，空间分离记为1；三者之和为 OCI值。当OCI=0时，交配方式为闭花受精；当OCI=1时，为专性自交；当OCI=2时，为兼性自交；当OCI=3 时，自交亲和，有时需要传粉者；当OCI=4 时，异交，部分自交亲和且需要传粉者［12］。

1.6 花粉-胚珠比（P/O）的测定

将辣木单花子房解剖，花药溶解，并置于显微镜下统计单花胚珠数及花粉数。依据Cruden的标准判断交配方式：P/O值为2.7～5.4时，闭花受精；为18.1～39.0时，专性自交；为31.9～396.0时，兼性自交；为244.7～2588.0时，兼性异交；为2108.0～195525.0时，专性异交［13］。

1.7 数据处理

采用Image-Pro Plus软件统计辣木花粉总数和花粉萌发数，采用Excel 2007软件进行数据统计，SAS 9.0软件进行方差分析，GraphPad Prism 6软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 辣木花部的形态特征

辣木花形态特征性状测定结果见表1，具体形态和开放状态见图1，辣木花序腋生，为圆锥花序，由上到下无明显的开放顺序（图1A）。花有梗，气味芳香，花瓣呈白色，底部微红，左右对称，花瓣5片，最上一片花瓣较大，中间两瓣次之，最下两瓣最小，且联合呈龙骨状（图1G），花瓣直径9.29～12.56 mm，长度为10.65～13.08 mm。萼筒盆状，花萼5片，线状披针形，呈白色（图1F），直径为8.51～13.68 mm，长度为8.18～12.01 mm，花朵开放后向下弯曲。雄蕊5枚，平均长度为7.91 mm，左右对称分布，底部密布短绒毛，其高度从中间到两边依次降低，花药黄色，退化雄蕊5枚（图1C，图1D）。雌蕊1枚，平均长度为7.52 mm，子房上位，子房外背短绒毛，尾部呈红色，花柱微弯曲（图1E）。辣木一年四季均可开花，且集中开花两次，单次花期1周左右，花朵开放第1天花蕾萌动，花萼先打开，第2天花瓣打开，随着花朵开放天数的增加，花瓣颜色逐渐加深，由白色变为淡黄色，并逐渐萎缩凋落；同时，柱头逐渐高于雄蕊，若授粉成功则结为果荚（图1H～图1N）。

表1 辣木花表型性状测定结果 mm

图1 辣木单花开放进程

2.2 花粉活力分析

采用离体萌发法对辣木花粉活力进行评估，由图2和图3可知，辣木花粉粒呈类球形，有一个萌发孔萌发出花粉管，花粉管内有内含物分布，其长度随着培养时间的延长逐渐增长。辣木花粉在现蕾期有微弱的花粉活力，随着花朵开放时间的延长，花粉活力逐渐增强，在花朵开放第3天时，花粉活力最强，且显著高于其余状态；第4天后，花粉活力显著降低，第6天花粉萌发率最低，但与第4、5天差异不显著。

图2 辣木花粉活力的测定

图3 辣木花粉萌发形态

2.3 柱头可授性分析

通过联苯胺—过氧化氢法对不同开放状态的辣木花柱头进行检测（表2，图4），结果表明，辣木花现蕾期柱头可授性较弱，部分不产生气泡，柱头无可授性；随着开放天数的增加，柱头可授性逐渐增强，当花朵开放达到第4、5天时，产生的气泡最多，冒出最迅速，反应液变蓝，柱头可授性最强；花朵开放第6天时，气泡生成减少，反应液不变色，可授性减弱。

图4 辣木柱头可授性检测

2.4 繁育系统评判

辣木花瓣直径9.29～12.56 mm，花冠直径＞6 mm，赋值为3；花药开裂时柱头具有可授性，赋值为0；雌雄器官在空间位置分离，赋值为1。辣木杂交指数OCI值累计分值等于4。根据Dafni的标准，初步判断繁育系统为部分自交亲和，异交则需要传粉者。

辣木花粉和胚珠形态见图3和图5，辣木花粉类球形，胚珠呈水滴形；单花花粉数平均为19400粒；胚珠数平均为22.67个；花粉—胚珠比（P/O）平均为855.76；据Cruden的标准，辣木P/O值在244.7～ 2588.0之间，初步判断辣木花属于兼性异交类型。

图5 辣木胚珠形态

3 结论与讨论

花粉活力的高低是辣木杂交育种成功的关键，本试验采用离体萌发法以及对辣木的花粉活力进行测定，发现辣木在开花第3天时花粉活力最高，与吕亚等［14］研究结果稍有不同，他们认为狭瓣辣木花粉活力在开花第2天达到最强，而PKM1花粉活力在开花第1天达最强。这可能是由于选用的辣木材料、植株生长环境不同而导致花粉活力的差异，花粉采集时间及培养环境的不同，亦会导致花粉活力的差异。黄琼等［15］研究表明薄壳山核桃花粉活力由高到低的变化规律为：散粉盛期＞散粉初期＞即将散粉期＞散粉末期。杨澜等［16］研究表明16个小时为红司花粉最适培养时间，且12～28 ℃有利于提高多肉植物红司的花粉萌发率，20～36 ℃有利于花粉管伸长。本试验对辣木单一材料秋季花期早晨9:00的花粉活力进行检测，而辣木品种材料多，且一年四季均可开花，后续还需增加不同辣木材料种类及对不同采样时间点的花粉活力进行检测，继续改进和完善辣木的花粉活力检测方法。

本试验采用联苯胺—过氧化氢法对柱头可授性进行测定，发现在辣木开花第1天就有可授性，第4、5天时柱头可授性最强。植物可通过自身的生理生化反应来维持柱头可授性，Bhattacharya［17］、刘辉［18］等研究表明辣木柱头可授性与柱头上分布的酯酶分泌物密切相关，酯酶分泌物在辣木开花第1天不表达，从开花第3天开始大量表达。相关研究［14］发现狭瓣辣木和PKM1柱头可授性均在开花第3天最强，该结果与本研究稍有差异，这可能是由于研究对象的不同导致的。不同的研究对象，植物柱头可授性持续时间长短不同，木地肤在开花第8～12天时柱头可授性最强［19］，野鸢尾柱头可授性在开花5～6 h最强［20］，兰州百合在开花当天8:00～12:00柱头可授性最强［21］。周英等［22］发现不同木槿品种的柱头可授性不同，浅紫红心等品种柱头可授性最强，牡丹木槿的最弱。

目前我国培育出的辣木品种主要有3种，PKM1、PKM2及红河一号［23］，辣木优质品种匮乏，繁育类型研究对促进辣木品种培育具有重要意义。辣木花朵开放第1天柱头就有可授性，第4天达到最强；花粉自开放第1天起就具有活力，5朵花药在柱头两侧由高到低排布，为辣木自花授粉创造了良好的环境条件。与此同时，辣木花粉黏连在花药上，不易吹落授粉，花朵气味芳香，单花可为传粉者提供60.5%糖含量的花蜜报酬物，主要传粉者为蜂类，使辣木接受外源花粉而进行异花授粉［24］。结合本研究的异交指数、花粉胚珠比的判定结果，笔者认为辣木的繁育类型为部分自交亲和，兼性异交繁育类型。

本文对辣木的花粉活力和柱头可授性进行测定，发现该辣木材料的花粉活力在开花第3天最强，柱头可授性在开花第4、5天达到最强，花粉活力最高时期与柱头可授性最强时期不重叠。后续开展杂交育种工作时，可选择在开花第3天时采取花粉保存，并于开花第4天或第5天进行授粉，授粉完成后立即套袋，防止传粉昆虫对授粉结果的影响。