miR-1277-5p/UBASH3A在类风湿关节炎中的功能及其靶标验证

宋建治 徐礼森

(武汉市第一医院，湖北 武汉 430022)

类风湿关节炎(RA)是一种全身性自身免疫性疾病，以滑膜内膜明显增生为特征，伴有严重的关节炎症〔1,2〕。RA是一种慢性疾病，会导致关节损伤和功能障碍，并给患者带来巨大的经济和社会负担〔3,4〕。RA的生物学发病机制仍未完全清楚。微小RNA(miRNA)在人类多种疾病中的重要调控功能已得到肯定，包括RA〔5,6〕，但仍有部分新发现的miRNA的功能需要探索。miR-1277-5p是一种近期在RA中发现的失调miRNA，其在RA中的功能尚未十分清楚。研究表明，含clip结构域的丝氨酸蛋白酶(UBASH)3A在多种自身免疫性疾病中起着关键作用，包括RA〔7〕。但是UBASH3A在RA中的功能及与miR-1277-5p之间的关系尚未清楚。本研究旨在探讨miR-1277-5p、UBASH3A在RA中的功能及关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1～10月武汉市第一医院确诊的RA关节置换术患者3例，意外事故导致的截肢或关节粉碎的患者2例。患者及家属均签署知情同意书。胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司；杜氏细胞培养基(DMEM)购自上海慧颖生物科技有限公司；细胞计数试剂盒(CCK)-8购自日本同仁化学研究所；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海宇玫博生物。

1.2方法

1.2.1细胞分离培养 参照彭菲菲等〔8〕的方法，将正常滑膜组织和RA滑膜组织采用组织块和酶消化法分离正常滑膜细胞和RA滑膜细胞，分别标记为正常组和RA组。将细胞使用DMEM培养基(10% FBS)进行常规的细胞培养、传代，用5～7代的细胞用于实验。

1.2.2实验分组 将分离培养的RA滑膜细胞标记为RA组、对照组，并将其随机分为miR-NC组、miR-1277-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-1277-5p组、pcDNA组、pcDNA-UBASH3A组、si-NC组、si-UBASH3A组、miR-1277-5p+pcDNA组、miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A组、anti-miR-1277-5p+si-NC组、anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A组。各组细胞均按1：3的量加入脂质体将相应的质粒或DNA进行转染。miR-NC组(转染miR-NC)、miR-1277-5p组(转染miR-1277-5p mimics)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-1277-5p组(转染anti-miR-1277-5p)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-UBA-SH3A组(转染pcDNA-UBASH3A)、si-NC组(转染si-NC)、si-UBASH3A组(转染si-UBASH3A)、miR-1277-5p+pcDNA组(共转染miR-1277-5p mimics和pcDNA)、miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A组(共转染miR-1277-5p mimics和pcDNA-UBASH3A)、anti-miR-1277-5p+si-NC组(共转染anti-miR-1277-5p和si-NC)、anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A组(共转染anti-miR-1277-5p和si-UBASH3A)，转入RA滑膜细胞，转染48 h，用qRT-PCR确认转染成功后用于后续实验研究。

1.2.3qRT-PCR 收集待检测的细胞，提取总RNA，并将其反转录为cDNA，-20℃保存、备用。用qRT-PCR试剂盒检测样本中的miR-1277-5p、UBASH3A mRNA表达。结果以U6、GAPDH为内参，2-△△Ct法计算miR-1277-5p、UBASH3A的表达水平。miR-1277-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAATATATATATATATGT-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；UBASH3A上游引物5′-GGA CTTGCACGACTAA-3′， 下游引物5′-CCGT-ACGTCAATTGAC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCG T-3′；GAPDH上游引物5′-CTCTGCTCCTCCTGTTC GAC-3′，下游引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。

1.2.4Western印迹实验 将需要检测的细胞裂解、提取总蛋白并定量和变性，用上清液进行蛋白电泳上样。用5%的分离胶和8%的浓缩胶进行电泳，再用转膜仪将蛋白从胶上转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，最后用2.5%脱脂奶粉封闭2 h。行一抗(1∶1 500)4℃孵育过夜，二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。用超敏电化学(ECL)发光试剂盒进行显影曝光。以目的条带灰度与内参条带灰度的比值表示蛋白的表达水平。

1.2.5CCK-8实验 将需要检测的细胞调整至105个/ml，按照CCK-8试剂盒要求操作，取适量细胞加入CCK-8溶液反应，终止反应后，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞增殖率为A490样本/A490对照×100%。

1.2.6流式细胞术 先将需要检测的细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，重悬，再用结合缓冲液将细胞悬浮。然后按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒要求操作，加入Annexin V-FITC、PI，避光反应15 min，结束后，快速上流式细胞仪进行结果检测分析。细胞凋亡率为Annexin V-FITC阳性率与PI阳性率之和。

1.2.7生物信息学预测 使用生物信息学在线预测网站mircode(http://mircode.org/)和StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn)预测与UBASH3A存在结合位点的miRNA，从中筛选保守的miRNA。另一方面结合NCBI中上传的RA相关的差异miRNA表达谱分析，确定miRNA。

1.2.8双荧光素酶报告实验 首先通过化学合成野生型UBASH3A片段(UBASH3A-WT)和突变型UBASH3A片段(UBASH3A-MUT)，再将其克隆至psiCHECK2载体，构建荧光素酶报告载体并提取质粒。用8倍质粒量的脂质体将miR-NC、miR-1277-5p、anti-miR-NC、anti-miR-1277-5p分别与psiCHE CK2-UBASH3A-WT、psiCHECK2-UBASH3A-MUT共转染48 h。用双荧光素酶报告基因检测实验检测所处理细胞的荧光素酶活性。测量萤火虫荧光素酶的活性(F)，在测量海肾荧光素酶荧光强度(R)，结果以二者的比值(R/F)表示。

1.3统计学方法 采用PEMS3.2软件进行单因素方差分析、LSD-q检验、t检验。GraphPad Prism6.0进行相关图片的绘制。

2 结 果

2.1各组miR-1277-5p、UBASH3A水平比较 与对照组关节滑膜细胞相比，RA组关节滑膜细胞中miR-1277-5p表达水平明显降低，UBASH3A mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。见图1和表1。

2.2miR-1277-5p对RA滑膜细胞增殖、凋亡的调控 与miR-NC组相比，miR-1277-5p组RA滑膜细胞miR-1277-5p mRNA表达水平明显升高，细胞增殖率明显降低，细胞凋亡率明显升高，增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡抑制蛋白(XIAP)表达水平明显降低，P16、裂解DNA修复酶(cleaved-PARP)蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-1277-5p组RA滑膜细胞miR-1277-5p mRNA表达水平明显降低，细胞增殖率明显升高，细胞凋亡率明显降低，PCNA、XIAP蛋白表达水平明显升高，P16、cleaved-PARP蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图2、表2、图3。

图1 UBASH3A在RA滑膜细胞中表达

表1 各组miR-1277-5p、UBASH3A表达

图2 miR-1277-5p对RA滑膜细胞凋亡的调控

表2 miR-1277-5p对RA滑膜细胞增殖、凋亡的影响

1～5：对照组,miR-NC组，miR-1277-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-1277-5p组图3 RA滑膜细胞增殖凋亡相关蛋白的表达

2.3miR-1277-5p靶向UBASH3A 生物信息学预测结果见图4，miR-1277-5p与UBASH3A之间存在连续的7个核苷酸互补结合位点。与miR-NC组相比，miR-1277-5p组UBASH3A-WT细胞荧光素酶活性明显降低，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-1277-5p组UBASH3A-WT细胞荧光素酶活性明显升高(P<0.05)。miR-1277-5p负向调控UBASH3A蛋白表达水平(P<0.05)。见图5和表3。

图4 miR-1277-5p与UBASH3A之间的结合位点

1～4：miR-NC组，miR-1277-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-1277-5p组图5 miR-1277-5p调控UBASH3A蛋白表达

表3 miR-1277-5p直接调控

2.4UBASH3A对RA滑膜细胞增殖、凋亡的调控 与pcDNA组相比，pcDNA-UBASH3A组RA滑膜细胞UBASH3A mRNA表达水平明显升高，细胞增殖率明显升高，细胞凋亡率明显降低，PCNA、XIAP蛋白表达水平明显升高，P16、cleaved-PARP蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与si-NC组相比，si-UBASH3A组RA滑膜细胞UBASH3A mRNA表达水平明显降低，细胞增殖率明显降低，细胞凋亡率明显升高，PCNA、XIAP蛋白表达水平明显降低，P16、cleaved-PARP蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图6、表4、图7。

图6 UBASH3A处理的RA滑膜细胞凋亡

表4 UBASH3A对RA滑膜细胞增殖、凋亡的调控

1～4：pcDNA组，pcDNA-UBASH3A组，si-NC组，si-UBASH3A组图7 UBASH3A处理的RA滑膜细胞增殖、凋亡相关蛋白表达

2.5过表达UBASH3A部分逆转miR-1277-5p对RA滑膜细胞增殖、凋亡的作用 与miR-1277-5p+pcDNA组相比，miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A组RA滑膜细胞miR-1277-5p mRNA表达水平明显降低，细胞增殖率明显升高，细胞凋亡率明显降低，PCNA、XIAP蛋白表达水平明显升高，P16、cleaved-PARP蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图8、图9、表5。

图8 过表达UBASH3A和miR-1277-5p处理的RA滑膜细胞凋亡图

1，2：miR-1277-5p+pcDNA组,miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A组图9 Western印迹检测PCDNA、P16、XIAP、cleaved-PARP水平

表5 过表达UBASH3A部分逆转miR-1277-5p对RA滑膜细胞增殖、凋亡的调控

2.6抑制UBASH3A逆转anti-miR-1277-5p对RA滑膜细胞增殖、凋亡的作用 与anti-miR-1277-5p+si-NC组相比，anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A组RA滑膜细胞miR-1277-5p mRNA表达水平明显升高，细胞增殖率明显降低，细胞凋亡率明显升高，PCNA、XIAP蛋白表达水平明显降低，P16、cleaved-PARP蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见表6、图10、图11。

表6 抑制UBASH3A逆转anti-miR-1277-5p对RA滑膜细胞增殖、凋亡的作用

图10 抑制UBASH3A和miR-1277-5p处理的RA滑膜细胞凋亡

1，2：anti-miR-1277-5p+si-NC组,anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A组图11 抑制UBASH3A和miR-1277-5p处理的RA滑膜细胞增殖、凋亡相关蛋白电泳

3 讨 论

研究证实miRNA在RA中具有重要作用〔5,9〕。Crowe等〔10〕报道，miR-1277-5p是人骨关节炎(OA)软骨细胞中异常下调的miRNA之一。Wang等〔11〕研究显示，miR-1277-5p可同时靶向长链非编码RNA X失活特异性转录本(XIST)、基质金属蛋白酶(MMP)-13和血小板反应蛋白1型基序5的ADAM金属肽酶(ADAMTS5)参与OA发展，具体为XIST通过在OA中起miR-1277-5p的竞争性内源RNA(ceRNA)的作用来促进MMP-13和ADAMTS5表达，促进细胞外基质(ECM)降解。本研究结果说明miR-1277-5p在RA滑膜细胞的增殖、凋亡中具有关键作用。进一步研究发现，miR-1277-5p还可靶向UBASH3A，这可能与miR-1277-5p在RA中的功能具有联系。研究在韩国和欧洲人群中通过全基因组分析发现两个新的RA易感基因(UBASH3A和SYNG-R1)〔12〕。Liu等〔13〕研究中也报道，UBASH3A与RA患者的疾病严重程度具有紧密相关性。Yang等〔14〕研究发现，RA患者的 外周血单核细胞(PBMC)中UBASH3A的mRNA表达异常增加，揭示UBASH3A失调可能与RA的发病有关，并且UBASH3A基因多态性(rs1893592和rs3788013)可能导致中国汉族人群RA的易感性。本研究结果说明UBASH3A在RA中的失调，确实具有促进RA病情发展的作用；UBASH3A能够恢复miR-1277-5p在RA滑膜细胞增殖、凋亡中的作用。这些结果为miR-1277-5p、UBASH3A在RA中的功能探索奠定基础。