河北省野鼠立克次体感染调查

刁丹红, 王蒋丽, 郭文平, 李彩云, 杨欢欢, 李雁飞, 谢广成

立克次体(Rickettsia)为原核单细胞微生物，其专性寄生于真核细胞内。由该类菌引起的立克次体病是一类重要的人兽共患疾病[1-2]。近年来，世界范围出现多种新发及再发立克次体病[3-5]。我国在新疆、黑龙江、云南等地野生动物和/或患者样本中检出或分离到某些致病性立克次体[6]。

由于立克次体严格胞内寄生这一特性，人们很难用传统的细菌学分类手段对该类菌进行区分。16SrRNA基因由于其高变区有种属特异性，保守区在各细菌之间差异不大的特点，已经成为最适合细菌属种分类鉴定的目的基因[7-8]。立克次体属的柠檬酸合成酶基因(gltA)、外膜蛋白A(ompA)基因为鉴定立克次体种的常用基因[9]。立克次体的ompA基因序列具有种内差异，为种内菌株分型的目的基因[10]。

本研究捕获河北省南部和东北部两个特定地区的野鼠作为调查对象，扩增鼠脾脏样本的立克次体16SrRNA、ompA、gltA基因，并对扩得的目的基因片段测序，对测定的基因序列进行同源性比对和系统发生树分析，研究当地立克次体的遗传特征和流行特征，为当地立克次体病预防与控制提供重要数据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备与试剂 PCR仪(Applied Biosystem，美国)、凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)、电泳仪(北京六一仪器厂，北京)、组织研磨机(上海净信实业有限公司，上海)、核酸提取仪(江苏硕世生物科技股份有限公司，江苏)、PCR master Mix(TIANGEN，北京)。

1.2 野鼠样本采集 2020年4月-9月，在河北省邯郸市及承德市选取的5个乡镇用粘鼠板和鼠笼法捕获野鼠，其中邯郸市50只，承德市50只，分别编号登记，无菌操作解剖，取脾脏样本，-80 ℃ 冻存待检。

1.3 脾DNA提取 每只鼠分别取约10 mg脾脏组织用研磨机进行研磨，使用硕世生物科技有限公司的组织DNA提取试剂盒(磁珠法)提取脾脏组织全DNA，并保存于-20 ℃ 备用。

1.4 PCR扩增 根据文献[11]中的引物(表1)采用半巢氏PCR进行立克次体16SrRNA、ompA、gltA基因的扩增，其中16SrRNA分为两段进行扩增。扩增条件为：94 ℃ 5 min后；94 ℃ 40 s、50 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，循环35次；最后72 ℃ 7 min。二轮扩增的PCR程序与第一轮相同。16SrRNA前后两半段、ompA、gltA扩增产物目的片段的大小分别为950 bp、700 bp、750 bp和1 000 bp。

表1 本研究所用引物

1.5 序列分析及遗传进化特征分析 PCR阳性产物送至北京擎科生物技术有限责任公司进行测序，所得序列先用blast进行比对分析，然后用Lasergene程序计算序列之间的同源性，用MEGA 6.0中的最大似然法(ML)构建系统发生树，核苷酸替代模型为GTR+I+G，分析采用Bootstrap Replication的值为100。

2 结 果

2.1 PCR电泳结果 在河北省邯郸市和承德市分别采集50只野鼠，根据形态学特征与线粒体cytb基因分析，邯郸市捕捉到的老鼠为黑线姬鼠，承德市捕捉到的为褐家鼠。将100只鼠的脾脏组织分别提取DNA做模板，采用PCR扩增立克次体的16SrRNA基因，然后扩增阳性标本的ompA基因及gltA基因，扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳成像。结果检出6只野鼠样本的3个目的基因扩增均为阳性(图1)，4个目的基因扩增片段分别约为950 bp、700 bp、750 bp和1 000 bp，与预期目的片段大小相符。承德市褐家鼠的立克次体感染率为8%(4/50)，邯郸市黑线姬鼠的立克次体感染率为4%(2/50)。

M:DL2000 maker; 1-6:鼠脾脏样本

2.2 16SrRNA基因测序结果分析 将6株立克次体的16SrRNA基因进行同源性分析，它们之间的同源性为99.9%～100%。此外，这6条16SrRNA基因序列与GenBank中劳氏立克次体相应基因之间的序列同源性最高，为99.9%～100%。下载GenBank中立克次体的已知16SrRNA基因序列，用MEGA 6.0中的ML方法构建的系统发生树(图2)。在16SrRNA基因序列的系统发生树上，本研究中检出的6个菌株与劳氏立克次体有最密切的亲缘关系，位于同一分支。提示从河北两地野鼠中检出立克次体均为斑点热群的劳氏立克次体。本研究中获得的16SrRNA基因序列的GenBank登记号为MZ292055～MZ292060。

图2 基于立克次体16S rRNA基因序列构建系统进化树

2.3ompA基因和gltA基因测序结果分析 本研究中获得的6条立克次体的ompA基因的同源性为99.7%～100%；此外，这6条ompA基因序列与GenBank中劳氏立克次体相应基因序列之间的同源性最高，为98.8%～100%。采用ompA基因序列构建的系统发生树上，结果显示河北6个立克次体菌株与劳氏立克次体有最密切的亲缘关系，与我国其它地区检出的劳氏立克次体位于同一分支。本研究中获得的6条立克次体的gltA基因的同源性为100%；此外，这6条gltA基因序列与GenBank中劳氏立克次体相应基因序列之间的同源性最高，为99.9%～100%。采用gltA基因序列构建的系统发生树上，结果显示河北立克次体与劳氏立克次体的位于同一分支，与我国其它地区发现的劳氏立克次体的亲缘关系最近(图3)。本研究中获得的ompA与gltA基因序列的GenBank登记号为MZ297803～MZ297814。

图3 基于立克次体ompA基因(左)与gltA基因(右)序列构建系统进化树

3 讨 论

本课题从河北省南部和东北部两个代表性地区捕捉野鼠提取鼠脾脏的DNA样本，采用PCR方法扩增鼠样本的立克次体16SrRNA、ompA和gltA基因进行立克次体的检测与鉴定。脾脏是重要的机体免疫器官，是血液循环过程的一个过滤器官，因此血液中的病原体会经过脾脏，它们可能被脾脏免疫活性细胞吞噬清除，某些病原体可以在脾脏细胞内生长繁殖，再次进入血液。因此，脾脏组织是否带菌可以作为机体是否曾发生过或正存在菌血症的一种反映。同时，有研究结果显示，脾脏组织检查适合监测依靠鼠作为贮存宿主而传播的病原体[12]。因此，通过动物宿主研究病原体存在状况时，我们应根据所研究病原体的组织亲嗜性特征选择对应靶器官或组织。因此，本研究选取了脾脏组织标本进行立克次体的检测。检测结果表明邯郸与承德市的啮齿动物立克次体感染阳性率为6%，同源性与系统发生树分析证明野鼠携带的立克次体病原体为劳氏立克次体。本研究中，鼠的立克次体感染率与内蒙古西部口岸地区啮齿动物携带立克次体的阳性率一致(6.18%)[13]，高于云南省泸西县和黑龙江省逊克县啮齿动物中立克次体的阳性率[14-15]，但远远低于新疆北疆地区啮齿动物中立克次体的阳性率(34%)[16]。

能够感染人的立克次氏体目成员包括无形体科与立克次体科。其中的立克次体科又包含立克次体属和东方体属。而立克次体属又可分为斑疹伤寒群立克次体和斑点热群立克次体。目前国际上已经鉴定出30余种斑点热群立克次体，其中已经证明对人致病的有20多种[9]。在我国，已发现的立克次体也有10多种[17]。在2015-2016年，内蒙古、河南、山东等地已报道劳氏立克次体感染的病例[18]。在此次研究中，河北检出的6株立克次体与黑龙江、内蒙古分离出的劳氏立克次体有最密切的亲缘关系。河北省位于中国华北地区，东南部、南部衔山东和河南省，北部与内蒙古交界。我们的研究证明河北省部分区域的野鼠携带立克次体，野生啮齿动物为立克次体贮存宿主，因此这些野鼠生活地区可为立克次体感染的自然疫源地。下一步我们将扩大河北省区域筛查范围，除检查野生啮齿动物外，也检测蜱作为传播媒介携带立克次体种类和感染水平，以判断哪些立克次体病原体有传播的可能性，为河北省立克次体病的预防和控制提供可靠数据支持。

利益冲突：无

引用本文格式：刁丹红,王蒋丽,郭文平，等.河北省野鼠立克次体感染调查[J].中国人兽共患病学报，2022，38(1)：84-88.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.168