高效液相色谱-一测多评法同时测定金佛止痛丸中8 种成分含量*

2022-08-09李俊霞刘松游秋霞

中国药业 2022年15期

李俊霞，刘松，游秋霞

（遂成药业股份有限公司，河南郑州 451100）

金佛止痛丸由醋延胡索、白芍、郁金、姜黄、三七、佛手、甘草7 味中药材加工而成，主要用于治疗气血瘀滞所致胃脘疼痛和痛经，以及消化性溃疡、慢性胃炎引起的疼痛［1］。中药制剂通常由多味中药材按中医理论君、臣、佐、使配伍而成，所含成分复杂，同时生产制剂所用中药材因产地、采收季节等的不同而导致质量差异较大，其现行质量标准［1］和文献［2 -5］仅对其所含芍药苷、延胡索乙素等成分进行了定量研究，难以全面反映金佛止痛丸的整体质量，多指标成分质量控制模式已广泛应用于中药及中药制剂，尤其是中成药复方制剂。一测多评（QAMS）法［6-7］实现了对多个成分的同时测定，解决了个别对照品分离难度大、单体不稳定、难以供应或价格昂贵等弊端，得到了广泛认可。本研究中采用高效液相色谱-一测多评（HPLC -QAMS）法，以去甲氧基姜黄素为内参物，对金佛止痛丸君药醋延胡索主要药效成分延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱，臣药白芍代表性成分氧化芍药苷和芍药苷，以及佐药郁金、姜黄共有活性成分双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量进行同时测定，为全面评价金佛止痛丸的整体质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；色谱柱为Ultimate AQ-C18柱（月旭科技上海股份有限公司）；Kromasil C18柱（瑞典Kromasil公司）；Symmetry C18柱（美国Waters公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius 公司，精密为0.01 mg）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号110736 -201943，CAS 号23180 -57 -6，含量95.1%），双去甲氧基姜黄素对照品（批号112004 -201501，CAS 号33171 -05 -0，含量95.0%），去甲氧基姜黄素对照品（批号112003 -201501，CAS 号22608-11-3，含量98.5%），姜黄素对照品（批号110823 -201706，CAS 号458 -37 -7，含量98.7%），延胡索乙素对照品（批号110726 -201819，CAS 号2934-97-6，含量99.8%），均购于中国食品药品检定研究院；氧化芍药苷对照品（批号18031641，CAS号39011 -91 -1，含量98.8%），紫堇碱对照品（批号17110821，CAS 号518-69-4，含量99.6%），均购于上海同田生物技术有限公司；去氢紫堇碱对照品（成都普瑞法科技开发有限公司，批号PRF8062141，CAS 号30045-16-0，含量97.8%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；金佛止痛丸（广州白云山中一药业有限公司，批号分别为R01008，R01006，R01005，规格为每袋5 g）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Ultimate AQ -C18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～12.0 min 时16.0%A，12.0～23.0 min 时16.0%A →38.0%A，23.0～41.0 min 时38.0%A →55.0%A，41.0～60.0 min 时55.0%A → 78.0%A，60.0～70.0min时78.0%A→16.0%A）；流速：1.0mL/min；检测波长：230 nm（0～23.0 min时检测氧化芍药苷和芍药苷）［8-10］，420 nm（23.0～41.0 min 时检测双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素）［11-15］，280 nm（41.0～70.0 min 时检测延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱）［16-18］；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液在此色谱条件下的色谱图见图1。可见，金佛止痛丸中待测8 种成分色谱峰均可达到有效分离，分离度均大于1.5，理论板数均大于4 500，且阴性对照品溶液对金佛止痛丸中8种化学成分的同时测定无干扰。

2.2 溶液制备

混合对照品贮备液：分别取8 种对照品各适量，精密称定，用稀乙醇制成质量浓度分别为0.526，5.172，0.398，0.316，1.132，0.274，0.192，0.118 mg/mL 的混合对照品贮备液。

混合对照品溶液：精密量取混合对照品贮备液2.5 mL，用稀乙醇制成含氧化芍药苷26.3 µg/ mL、芍药苷258.6 µg/ mL、双去甲氧基姜黄素19.9 µg/ mL、去甲氧基姜黄素15.8µg/mL、姜黄素56.6µg/mL、延胡索乙素13.7 µg/ mL、去氢紫堇碱9.6 µg/ mL、紫堇碱5.9µg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取金佛止痛丸样品，研细，取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称定质量，加热回流提取45 min，放冷，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

阴性对照品溶液：按2020 年版《中国药典（一部）》中金佛止痛丸的工艺处方分别制备不含醋延胡索、不含白芍、不含郁金和姜黄的3 种阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取2.2项下混合对照品贮备液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，各置20 mL容量瓶中，用稀乙醇定容，摇匀，制成标记为Ⅰ～Ⅵ的系列混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以8 种待测成分的质量浓度（X，µg/ mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

精密度试验：取2.2 项下供试品溶液，重复进样测定6次，记录色谱图，并计算峰面积。结果见表1，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为R01008）样品6份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，依法进样测定，记录色谱图及峰面积，按外标法计算含量及RSD值。结果见表1，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为R01008）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于0，3，6，12，18，24 h时进样测定，记录色谱图，并计算峰面积的RSD值。结果见表1，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取已知8种化学成分含量的样品9份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液（分别含氧化芍药苷0.372 mg/mL、芍药苷3.796 mg/mL、双去甲氧基姜黄素0.308 mg/ mL、去甲氧基姜黄素0.226 mg/ mL、姜黄素0.674 mg/ mL、延胡索乙素0.188 mg/ mL、去氢紫堇碱0.152 mg/ mL、紫堇碱0.094 mg/mL）0.5，1.0，1.5 mL，各3份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 金佛止痛丸中8种成分含量测定方法学考察结果Tab.1 Results of content determination methodology of eight components in Jinfo Zhitong Pills

2.4 相对校正因子（RCF）测定

取线性关系考察项下系列混合对照品溶液Ⅰ～Ⅵ进样测定，记录色谱图及峰面积，以去甲氧基姜黄素为内参物，按如下公式计算RCF。

式1）中，Ak为内参物峰面积，Ws为其他成分质量浓度，As为其他成分峰面积，Wk为内参物质量浓度。计算得其他7种成分的RCF，结果见表2。

表2 以去甲氧基姜黄素为内参物的7种成分的相对校正因子Tab.2 RCFs of seven components with demethoxycurcumin as the reference substance

2.5 RCF 耐用性考察

色谱仪和色谱柱：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，依法进样测定，记录8 种成分的峰面积，考察UltiMate 3000 型、Agilent 1260 型高效液相色谱仪和Ultimate AQ -C18柱、Kromasil C18柱、Waters Symmetry C18柱对RCF的影响。结果在此色谱仪和色谱柱条件下，氧化芍药苷、芍药苷、双去甲氧基姜黄素、姜黄素、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的平均RCF分别为0.853 3，1.185 7，0.761 7，0.622 9，1.172 8，1.093 3，1.811 7，RSD分别为1.12%，1.21%，0.81%，1.44%，1.71%，1.32%，1.46%（n=6）。

柱温：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液适量，依法进样测定，记录8 种成分的峰面积，考察不同柱温（25，28，30，32，35 ℃）对RCF 的影响。结果在此柱温条件下，氧化芍药苷、芍药苷、双去甲氧基姜黄素、姜黄素、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的平均RCF 分别为0.852 7，1.183 8，0.760 3，0.616 2，1.169 0，1.095 8，1.808 7，RSD分别为1.46%，1.19%，0.99%，1.20%，1.81%，1.37%，1.89%（n=5）。

流速：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液适量，依法进样测定，记录8 种成分的峰面积，考察不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL/ min）对RCF 的影响。结果在此流速下，氧化芍药苷、芍药苷、双去甲氧基姜黄素、姜黄素、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的平均RCF分别0.852 3，1.184 7，0.758 4，0.617 2，1.175 1，1.094 2，1.805 3，RSD分别为1.20%，0.93%，1.23%，1.55%，1.64%，1.19%，1.34%（n=5）。

2.6 待测组分色谱峰的定位

以内参物去甲氧基姜黄素色谱峰为基准峰，考察在UltiMate 3000 型、Agilent 1260 型高效液相色谱仪和Ultimate AQ -C18柱、Kromasil C18柱、Waters Symmetry C18柱条件下，氧化芍药苷、芍药苷、双去甲氧基姜黄素、姜黄素、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱色谱峰与去甲氧基姜黄素色谱峰的相对保留时间，并采用相对保留时间值法对色谱峰进行定位。结果见表3。

表3 不同色谱仪和不同色谱柱对相对保留时间的影响Tab.3 Effects of different chromatographs and chromatographic columns on the relative retention time

2.7 QAMS 法与外标（ESM）法测定结果比较

取3 批（批号分别为R01008，R01006，R01005）样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，依法进样测定，记录氧化芍药苷、芍药苷、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的峰面积，分别以ESM 法和QAMS 法计算各成分含量，采用SPSS 26.0 统计学软件对2 种方法所得结果进行独立样本t检验。结果见表4。

表4 金佛止痛丸中8种成分一测多评法和外标法含量测定结果比较（n=3）Tab.4 Comparison of the content determination of eight compo⁃nents in Jinfo Zhitong Pills by the QAMS and the ESM（n=3）

3 讨论

3.1 定量测定化学成分及内参物的选择

金佛止痛丸由醋延胡索、白芍、郁金、姜黄、三七、佛手、甘草7 味中药材制成。方中，醋延胡索行气止痛，为君药；白芍柔肝和胃、养血调经，三七祛瘀生新，共为臣药；佛手疏肝理气、和胃止痛，郁金行气解郁、活血止痛，姜黄破血行气、通经止痛，共为佐药；甘草补脾益气、缓急止痛、调和诸药，为使药。诸药合用，共奏行气止痛、舒肝和胃、祛瘀生新之功效。中药制剂在中医理论指导下遵循以君药所含成分为主，兼顾臣药、佐药、使药所含成分［19-20］。本研究中选取方中君药醋延胡索所含主要药效成分延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱，臣药白芍所含代表性成分氧化芍药苷和芍药苷，以及佐药郁金、姜黄共有活性成分双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素为定量研究指标成分，同时选取性质稳定、对照品易得、检测中出峰时间居中、含量较高的去甲氧基姜黄素为内参物，以全面评价金佛止痛丸的整体质量。

3.2 色谱条件选择

试验中以水为流动相水相，以金佛止痛丸中定量测定成分氧化芍药苷、芍药苷、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱的分离效果为主要指标，对有机相（甲醇、乙腈）进行考察，结果乙腈优于甲醇。遂以乙腈为有机相，对水相（0.1%冰醋酸溶液［11-12，16，18］、0.1%磷酸溶液［8-10，13，15，17］、0.1%甲酸溶液）进行考察，结果乙腈-0.1%磷酸水溶液流动相体系对金佛止痛丸中8 种成分的分离效果最佳，色谱图基线较平稳。最终确定按2.1项下的流动相程序对金佛止痛丸中8种成分的含量进行同时测定。

3.3 供试品溶液制备方法选择

试验中以金佛止痛丸中8 种成分的综合提取率为考察指标，分别对提取溶剂（甲醇［11-12］、95%乙醇［15］、75%乙醇［13，16］、稀乙醇［8-10］）和提取方法（加热回流［8，11，13，17］、超声［9-10，15-16］）进行考察，结果以稀乙醇为提取溶剂，加热回流提取45 min时，8 种目标成分的综合提取率最佳。故选择稀乙醇加热回流提取45 min作为供试品处理方法。