液相色谱法测定食品中纳他霉素的方法验证

◎ 陈秀英

（广州市增城质量技术监督检测所，广东 广州 511300）

纳他霉素是一种多烯大环内酯类的真菌抑菌剂，具有很强的抗真菌能力，特别能有效地抑制霉菌和酵母菌的生长，在某些产品中甚至比常用的脱氢乙酸更能有效地抑制真菌[1-4]。其不仅抑制效果好，且在哺乳动物中的毒性不强，因此被广泛用于食品中。

根据实验室资质认定相关要求，在方法使用前需进行验证，以确保本实验室的人员、设备、环境和耗材能满足开展《食品中纳他霉素的测定 液相色谱法》（GB/T 21915—2008）的需求，故本文对食品中纳他霉素的检测展开了方法验证[5-6]。验证内容包括仪器设备是否合适、标准物质与耗材是否满足检验需求、方法性能指标——检出限、线性范围、基质效应、精密度和正确度能否达到标准规定的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（CH3OH，色谱纯），CNW Technologies；冰乙酸（CH3COOH，分析纯），广州化学试剂厂；实验用水为超纯水；纳他霉素有证标准物质（CAS：7681-93-8），中国计量科学研究院。

1.2 仪器和设备

LC-2010AHT高效液相色谱仪配紫外检测器（日本岛津公司）；AR224CN型天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]，感量为0.000 1 g；恒温水浴锅； KQ-500E型超声清洗器（昆山超声）；BCD-216SDN冰箱（Haier）；TDZ4-WS台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3 仪器参数

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm×5 µm（岛津Ankylo C18）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：305 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL；流动相：甲醇+水+乙酸=60+40+5。

1.4 实验方法

1.4.1 样品制备

（1）乳酪、火腿、酸奶等基质。准确称取10.00 g 样品到50 mL比色管中，加入30 mL甲醇，超声提取30 min，加水约10 mL，定容到50 mL刻度线，摇匀放入冰箱中冷冻1 h，取出冷冻后的样品立即用有机相进行过滤。滤液放置室温后，依次过0.45 µm和0.22 µm针头式过滤器，收集滤液约2 mL并上机测定。

（2）月饼、糕点基质。准确称取5.00 g样品到50 mL比色管中，置于离心管中，加入30 mL甲醇，超声提取30 min，加水定容到50 mL刻度线，摇匀后置于离心机中，以3 500 r·min-1的转速离心5 min。上清液依次过0.45 µm和0.22 µm针式过滤器，收集滤液约2 mL，上机测定。

（3）果汁饮料等基质。准确量取果汁饮料样品 10 mL到50 mL比色管中，加入30 mL甲醇，超声提取30 min，加水定容到50 mL刻度线。提取液依次过 0.45 µm和0.22 µm针头式过滤器，收集滤液约2 mL上机测定。

1.4.2 标准曲线绘制

准确称取适量的纳他霉素标准品，用甲醇溶解，配成浓度为479.2 µg·mL-1的储备液。然后量取1.0 mL储备液到10 mL的容量瓶中，用甲醇定容到10 mL刻度线,摇匀配成47.92 µg·mL-1的中间液。再分别量取适量的中间液，用甲醇稀释到10 mL，配成0.479 2 µg·mL-1、 1.916 8 µg·mL-1、4.792 0 µg·mL-1、9.584 0 µg·mL-1、19.170 0 µg·mL-1和47.920 0 µg·mL-1等不同浓度的标准系列。以纳他霉素的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及相关系数

按照1.3的实验仪器参数上机，标准曲线方程是Y=51 993x，相关系数R2=0.999 1，符合《合格评定 化学分析方法确认及验证指南》（GB/T 27417—2017）[7]中R2大于0.99的要求。在0.479 2～47.920 0 µg·mL-1的浓度范围呈现良好的线性关系。

2.2 方法检出限

根据GB/T 27417—2017中“空白标准偏差法”进行检出限的测定。样品空白连续测定10次，计算出样品空白平均值（）和标准偏差S。

2.2.1 乳酪、火腿、酸奶等基质的检出限测定

由表1可知，样品最低检出浓度C=c-+3S=0.08 µg·mL-1， 样品空白平均值为0.075 3 µg·mL-1，按照试液定容体积V=50 mL，称样量m=10.0 g计，可算出检出限CLOD=C×V/m=0.438 mg·kg-1。

表1 样品空白平均值与标准偏差结果表

2.2.2 月饼、糕点基质的检出限测定

样品空白连续测定10次，得到的样品空白平均值=0.042 9 µg·mL-1，S=0.003 7 µg·mL-1，最 低 检 出浓度C=c-+3S=0.046 6 µg·mL-1，同理可计算出检出限CLOD=C×V/m=0.466 mg·kg-1。

2.2.3 果汁饮料基质的检出限测定

样品空白连续测定10次，得到的样品空白平均值=0.068 9 µg·mL-1，S=0.001 5 µg·mL-1，最 低 检 出浓度C=c-+3S=0.046 6 µg·mL-1，同理可计算出检出限CLOD=C×V/V2=0.367 mg·L-1。

2.3 精密度

精密度的测定通常需要自由度至少为6，故实验选取一个阳性样品，重复测定7次，结果如下。

2.3.1 乳酪、火腿、酸奶等基质的精密度

阳性样品的结果见表2。

2.3.2 月饼、糕点基质的精密度

阳性样品重复测定7次的平均值为18.217 mg·kg-1，变异系数（CV值）为1.59%。

2.3.3 果汁饮料基质的精密度

阳性样品重复测定7次的平均值为9.535 mg·L-1，变异系数（CV值）为1.71%。

2.4 回收率

称取6份已确认的空白样品，各加入一定量的标物，然后按1.4.1中的步骤进行处理。

2.4.1 乳酪、火腿、酸奶等基质的回收率

火腿的加标回收结果见表3。

表2 阳性样品7次检测结果表

表3 加标回收结果表

2.4.2 月饼、糕点基质的回收率

6份加标样品的回收率依次为101.10%、98.75%、95.32%、94.85%、99.15%和99.02%。

2.4.3 果汁饮料基质的回收率

6份加标样品的回收率依次为96.38%、96.24%、101.20%、101.80%、98.96%和99.15%。

3 结论

本实验室在现在设备及设施条件下，通过线性范围、检出限、精密度和正确度对不同类型代表的基质（乳酪、火腿、酸奶等基质、月饼、糕点等基质以及果汁饮料基质）进行验证。结果表明，标准曲线的相关系数R2为0.999 1，大于0.99；3种基质的检出限依 次 为0.438 mg·kg-1、0.466 mg·kg-1、0.367 mg·L-1， 均低于GB/T 21915—2008要求的“固体和半固体 0.5 mg·kg-1，液体样品0.5 mg·L-1”；3种基质的变异系数（CV值）依次为1.85%、1.59%、1.71%，依次低于GB/T 27417—2017要求的CV值（5.3%、5.3%、7.5%）（参考GB/T 27417—2017要求，当被测组分含量＜ 1 mg·kg-1时，变异系数要求＜7.5%；当被测组分含量＜100 mg·kg-1时，变异系数要求＜5.3%）； 3种基质的回收率依次为91.72%～96.30%、94.85%～ 101.10%、96.24%～101.80%，均符合GB/T 27417—2017 要求的当添加量在0.1～1.0 mg·kg-1时，回收率要求满足80%～110%的水平。从以上数据可知，本实验室能力满足GB/T 21915—2008标准要求。