柳州螺蛳粉汤料中氨基酸测定分析

◎ 陈荣珍，农真真，秦庆芳，武 源，林 华，刘永逸

（柳州市质量检验检测研究中心，广西 柳州 545006）

近年来，柳州螺蛳粉以其独特的酸、辣、鲜、爽和烫的风味，深受广大消费者的喜爱，一度成为网红食品[1]。柳州螺蛳粉的汤料由螺蛳、猪骨、鸡骨及香辛调味料加水熬制而成，浓郁爽口、风味独特。柳州螺蛳粉独特的风味来源除了浓郁的酸笋风味，还有其汤料中特殊的呈鲜味氨基酸成分[2-3]。目前未见有关于柳州螺蛳粉汤料中氨基酸检测的研究报道。故此，测定其氨基酸含量，对分析螺蛳粉鲜味来源具有重要意义。

氨基酸的分析方法主要有茚三酮衍生紫外分光光度法[4]、气相色谱法[5]、液相色谱法[6]、离子色谱法[7]、毛细管电泳检测紫外测定法[8]、衍生-电位传感法[9]、氨基酸自动分析仪法[10-12]和液相色谱串联质谱法 等[13-14]。氨基酸自动分析仪法操作简单方便，测定结果准确，是迄今氨基酸定性、定量分析中应用最广泛的方法之一。本研究建立了氨基酸自动分析仪测定柳州螺蛳粉汤料中天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的分析方法，为探讨其鲜味来源及营养价值提供参考，为柳州螺蛳粉特异性鲜味物质研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

AMINO A300型全自动氨基酸分析仪（德国曼默博尔公司）；XP26型微量电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；明澈-D24UV实验室超纯水系统[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]；TTL-DCⅢ型氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试剂及标准溶液

天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸 （纯度100%）和谷氨酸（纯度99.5%）（中国食品药品检定研究院）；盐酸（西陇科学股份有限公司）；苯酚（广东光华科技股份有限公司）；三水乙酸钠（西陇科学股份有限公司）；无水乙醇（湖南汇虹试剂有限公司）；甲酸（成都市科隆化学品有限公司）；乙酸（广东光华科技股份有限公司）；三氟乙酸（天津市福晨化学试剂厂）；氢氧化钠（西陇科学股份有限公司）；硼酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（西陇科学股份有限公司）；茚三酮衍生试剂R（德国曼默博尔公司）；茚三酮活化剂（德国曼默博尔公司）；反应器清洗液W（德国曼默博尔公司）；自动进样器清洗液（德国曼默博尔 公司）。

1.3 样品来源

样品来源均为本实验室自购样品，取其中汤料包。

1.4 仪器条件

色谱柱：阳离子交换柱；柱温：40 ℃；检测波长：440 nm；进样量：20 μL；流动相配制见表1；仪器进样程序见表2。

表1 流动相配制表

表2 分析程序表

1.5 标准溶液的配制

分别精密称取天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸适量，用水溶解并稀释制成浓度为1 mg·mL-1的标准储备液，再精密量取各标准储备液适量，用水稀释并配制成浓度约为1 μg·mL-1、2 μg·mL-1、6 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1和60 μg·mL-1的混合标准系列溶液。

1.6 试样溶液的制备

称取0.5 g样品置于玻璃水解管内，加入10 mL 6 mol·L-1盐酸溶液，随后加入3滴苯酚。将水解管放入冷冻剂中，冷冻5 min后，进行15 min氮吹，在氮吹状态下封口。将已封口的水解管置于110 ℃电热恒温鼓风干燥箱中水解22 h，水解完成后取出，冷却至室温。将水解液用滤纸过滤至50 mL容量瓶内，用纯水少量多次冲洗水解管，将水洗液移入同一50 mL容量瓶内，并用纯水定容，振荡混匀。准确吸取1.0 mL滤液移入氮吹管内，50 ℃氮吹至干，残渣用1 mL纯水溶解，再次用50 ℃氮吹干，目的是除酸完全。准确量取2.0 mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲溶液进行复溶，涡旋1 min，混匀后过0.22 μm滤膜，装进样小瓶，待测。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系及检出限试验

按照“1.5”项下方法制备混合标准系列溶液，按照“1.4”项下方法上机测定，以目标物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得出线性回归方程和相关系数。依据《氨基酸分析仪》（JJG 1064—2011）检定规程中检测限的测定方法，测定检出限和定量限，以各氨基酸组分2倍基线噪声与峰高的比值计算检出限，定量限为3倍检出限，结果见表3。

由表3可知，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸在0～60 μg·mL-1线性相关系数均大于0.999；当取样量为0.5 g，稀释体积为100 mL时，检出限为0.001 6～0.008 0 mg·g-1，定量限为0.004 9～ 0.024 0 mg·g-1，表明该方法线性关系良好，灵敏度高。

表3 线性方程及检出限、定量限表

2.1.2 稳定性试验

取浓度为6 μg·mL-1的混合标准溶液及处理好待测样品编号为1的样品溶液，各重复进样6次，按样品程序分析条件测定，测定完成后将混合标准品溶液及处理好待测样品编号为1的样品溶液置于4 ℃冰箱避光保存，保存7 d后，再次以相同程序测定，比较第1 d及第7 d各氨基酸的响应，结果见表4。

表4 稳定性试验结果表（n=6）

由表4可知，第7 d混合对照品溶液及样品溶液的峰面积与第1 d的峰面积差异较小，表明在4 ℃冰箱避光条件下，氨基酸混合对照品溶液及样品溶液的稳定性较好。

2.1.3 回收率及精密度试验

取编号为1的样品各0.5 g共6份，按表5分别加入标准溶液适量，按照“1.6”项下方法制备加标回收试样液，按照“1.4”项下方法进行测定，计算回收率，结果见表5。

由表5可知，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的加标回收率为95.80%～104.5%， 精密度为0.16%～4.80%，符合GB/T 27417—2017方法回收率偏差要求，表明方法的精密度和准确性 较好。

2.2 样品测定及结果

称取自购样品30批次，按照“1.6”项下方法制备试样液，按照“1.4”项下方法测定样品中6种氨基酸含量，结果见表6。从表6可以看出，不同批次样品均检测出天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸，表明柳州螺蛳粉汤料均含有天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸 6种呈鲜味氨基酸，是螺蛳粉鲜味的主要来源。不同生产厂家不同批次的样品氨基酸检测结果差异明显，但天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量和均大于1 mg·g-1，谷氨酸的含量除试样17外均小于80 mg·g-1。为保持柳州螺蛳粉的天然风味及健康饮食需求，6种呈鲜味氨基酸含量检测结果可为柳州螺蛳粉汤料鲜味特异性指标标准的制定提供技术参考。

表5 加标回收试验结果表（n=6）

表6 样品中各氨基酸测定结果表（单位：mg·g-1）（n=2）

3 结论与讨论

3.1 流动相对分离度的影响

氨基酸分析仪是通过不同pH流动相对各种氨基酸进行分离，通过氨基酸与茚三酮在一定温度下反应显色，在440 nm处测定。当流动相A的pH为2.78时，天冬氨酸（Asp）和苏氨酸（Thr）的分离度为1.12，分离效果差。根据分析进样程序可知，天冬氨酸和苏氨酸是在流动相A段出峰，故将流动相A的pH调高为2.93，天冬氨酸（Asp）和苏氨酸（Thr）的分离度为1.52，分离效果较好。

3.2 样品酸水解后除酸情况对保留时间的影响

以标准溶液各单标保留时间定位，天冬氨酸保留时间为15.623 min，当样品水解后仅取样液进行一次氮吹，天冬氨酸保留时间为16.597 min。当样品水解后，取样液进行一次氮吹，用水复溶后进行二次氮吹，再用2.0 mL pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液复溶上机，天冬氨酸出峰时间为15.600 min。由于使用酸水解样品，发现若样品除酸不完全，天冬氨酸保留时间产生漂移，样品天冬氨酸保留时间与标准溶液不一致；但样品水解后重复氮吹操作保证除酸完全，样品天冬氨酸保留时间与标准溶液一致。

3.3 结论

本研究建立了氨基酸自动分析仪测定柳州螺蛳粉汤料中天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的分析方法，样品处理操作简单方便，经方法学验证，检出限、定量限、精密度、稳定性及回收率均满足分析的要求，适用于柳州螺蛳粉汤料中6种氨基酸的同时测定，对柳州螺蛳粉特异性鲜味物质研究提供技术支持，对柳州螺蛳粉营养物质研究提供参考。