过热蒸汽灭菌松花粉的安全性毒理学评价研究

张惠惠，崔议方，宋书祎，兰先明，张中磊，李悦，张稳稳*，张加余*

(1.烟台市食品药品检验检测中心，山东 烟台 264003； 2.滨州医学院药学院，山东 烟台 264003)

松花粉为松科植物马尾松、油松或同属植物的干燥花粉，营养成分丰富，早在《神农本草经》中就已被记载，被认为“甘、温、无毒”，有“润心肺、益气、祛风止血、壮颜益志”的功效，是祖国医药学宝库中仅有的食药兼用花粉品种[1]，但是源自自然界的松花粉不可避免的会携带各种微生物，因此，对松花粉进行灭菌十分必要。目前，食品灭菌的方法有多种，应用最广的是辐照灭菌，其可在保证灭菌效果的基础上，能较好地保存花粉的营养成分[2]。一般来说，一定剂量内辐照灭菌食品是安全的，但仍有部分消费者不认可辐照食品。同时，随着消费者对食品安全卫生性能要求的提高，食品制造企业对微生物管理的要求也越来越严格[3]。

过热蒸汽是对饱和蒸汽继续加热，在相同压力下温度高于沸点的水蒸气，采用过热蒸汽灭菌能够使物料受热更均匀，传热更快，有效灭杀食品中的微生物及芽孢[4]。本文通过对过热蒸汽灭菌松花粉进行急性经口毒性试验、细菌回复突变(Ames)试验、哺乳动物红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验及大鼠28 d经口毒性试验等毒理学评价试验研究，旨在为过热蒸汽灭菌松花粉及其产品开发提供毒理学安全性评价实验依据。

1 材料与仪器

1.1 受试物 过热蒸汽灭菌松花粉(烟台新时代健康产业有限公司，过热蒸汽灭菌工艺：145～165 ℃，压力0.2～0.3 Mpa，4～6 s)，产品批号为1640512-1。

1.2 实验动物 SD大鼠和ICR小鼠均由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20140007。

1.3 菌株及S9 细菌回复突变试验选用经鉴定符合要求的菌株，均购自美国Moltox公司，其中S9批号：2895；TA1535批号：4694D；TA100批号：4678D；TA102批号：4677D；TA97a批号：4689D；TA98批号：4689D。

1.4 试剂试药与主要仪器 环磷酰胺(Sigma-Aldrich公司，批号：WXBC2421V)；AMES阳性对照药物：4-硝基喹啉氮氧化物(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：N113910)；叠氮钠(Amresco公司，批号：0639)；丝裂霉素(浙江海正药业股份有限公司，批号：131101)； 2-氨基芴(上海晶纯试剂有限公司，批号：13152)。

SW-CJ-2F双人双面超净工作台；MCO-20AIC恒温培养箱；DHG-9203A电热恒温干燥箱；DK-8D电子恒温水浴锅；HV-50高压灭菌器；Milli-Q IQ7000纯水仪；NanoDrop One C超微量分光光度计；Supcre G9全自动菌落计数分析仪；Sysmex XN-1000全自动模块式血液体液分析仪；Roche cobas c 311全自动生化分析仪。

2 实验方法

2.1 急性经口毒性试验 参照GB15193.3-2014，按照限量法设10 g·(kg·BW)-1剂量组。取SPF级ICR小鼠16只，体重18～22 g，雌雄各半，按照10 mL·(kg·BW)-1的灌胃容量灌胃0.5 g·mL-1的供试品混悬液2次，间隔4 h，连续观察14 d，观察动物的中毒表现和死亡情况。

2.2 细菌回复突变试验 参照GB15193.4-2014，采用平板掺入法，使用鉴定合格的鼠伤寒沙门氏菌突变型菌TA1535、TA100、TA102、TA97a、TA98五个菌株进行试验。试验设置5 000、2 500、1 250、625、312.5 μg/皿5个受试物剂量，另设空白对照组与阳性对照组，每个剂量做3个平行皿，整套试验在相同条件下重复做2次并分别统计。

2.3 小鼠精子畸形试验 参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，设置2.5、5和10 g·(kg·BW)-13个口服剂量组和环磷酰胺阳性对照组40 mg·(kg·BW)-1及阴性对照组，每组动物10只，通过口腔灌胃每24 h给药1次，连续给药5 d。末次给药后30 d 处死小鼠，取附睾制片，伊红染色，每只小鼠为一观察单位，计数1 000条完整的精子中畸形精子数，计算各组小鼠精子畸变率。

2.4 哺乳动物红细胞微核试验 参照GB15193.5-2014，设置2.5、5和10 g·(kg·BW)-13个口服剂量组，另设溶媒对照组、阳性对照组(腹腔注射给予40 mg·kg-1的环磷酰胺)，每组动物10只，通过口腔灌胃每24 h给药1次，连续给药2次，末次给药后约18～24 h内，取股骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色，在光学显微镜下，每只小鼠计数2 000个嗜多染红细胞，并记录微核发生率(‰)，同时计数200个骨髓红细胞[嗜多染红细胞(PCE)加正染红细胞(NCE)]，求出嗜多染红细胞/总红细胞的比值，即PCE/(PCE+NCE)的比值。如出现明显的剂量-反应关系，并有统计学意义，即确认为阳性结果。

2.5 28 d经口毒性试验 设5、2.5、1.25 g·(kg·BW)-13个剂量组和1个溶媒对照组，每组动物16只，雌雄各半。分笼饲养，自由摄食和饮水，连续灌胃28 d后试验结束。处死大鼠，观察血常规、血清生化学指标和病理检查。病理组织学检查时先对高剂量组和对照组动物的主要脏器进行，如果发现病变后需对较低剂量组相应的器官及组织制片检查。

2.6 统计分析 应用SPSS 26.0软件进行数据统计与分析，各组动物的微核率及 PCE/(PCE+NCE)比值采用均数±标准差描述；精子畸形实验阳性的判断标准是精子畸形发生率至少为阴性对照组的两倍或经统计学处理差异有统计学意义，并存在剂量-反应关系者，或者至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率达到阴性对照组的两倍或经检验差异具有统计学意义。大鼠28 d喂养实验数据同样采用均值±标准差描述。组间比较采用组间比较t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠急性毒性试验 以10 g·(kg·BW)-1剂量连续灌胃后观察14 d，小鼠存活率100%，且无明显异常状态。依据急性毒性分集评价标准判定，该受试物对小鼠LD50>5 g·(kg·BW)-1，属于实际无毒级。

3.2 细菌回复突变试验 在本试验条件下，各菌株自发回变菌落数(溶剂对照)在实验室正常范围内，阳性对照回变菌落数均明显高于溶剂对照(回变菌落数是溶剂对照2倍以上，且差异有统计学意义)，提示试验体系可靠。抑菌试验表明，松花粉样品浓度达5 000 μg/皿时，对所有菌株(TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535)均无抑菌作用。试验用此浓度作为最高浓度，结果表明细菌生长背景良好。不同浓度松花粉样品(5 000、2 500、1 250、625、312.5 μg/皿)，对所有测试的菌株无论在无S9代谢活化系统的直接作用还是经S9代谢活化系统作用后均未引起回变菌落数的增加(见表1～2)。

表1 Ames试验结果

表2 Ames试验结果

3.3 哺乳动物红细胞微核试验 受试物各剂量组与阴性对照组的微核发生率在0.6‰～1.3‰之间，环磷酰胺阳性对照组的微核发生率为雌性小鼠34.20‰，雄性小鼠27.20‰。各剂量组骨髓细胞微核率与阴性对照组相比较差异均无统计学意义(P>0.05)，而阴性对照组与环磷酰胺阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示未见该受试物哺乳动物红细胞微核试验结果为阴性。

3.4 小鼠精子畸形试验 受试物各剂量组与阴性对照组的小鼠精子畸形率在3.98%～4.10%之间，环磷酰胺阳性对照组为8.71%，各剂量组动物精子畸形率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，而阴性对照组与环磷酰胺阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，提示未见该受试物对雄性小鼠的精子产生致突变作用。

3.5 28 d经口毒性试验 试验期间各组动物未见明显中毒表现，大鼠生长发育良好，试验结束时，无动物死亡。各剂量组动物体重、体重增加与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)；血液学指标、血生化指标、脏器绝对重量及脏/体比值与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)；病理组织学检查，各剂量组大鼠的脏器未发现异常，脏器系数与对照组比较未见明显统计学差异，提示该受试物对大鼠的脏器组织无损害作用(见表3～5)。

表3 松花粉对动物体重的影响

表4 松花粉对血液学指标的影响

表5 松花粉对血生化指标的影响

4 讨论

松花粉是一味历史悠久的药食同用类中药，曾有记载称松花粉在春季采集，禀天春和之木气，得地中正之土味，归足厥阴肝、足太阴脾二经，有益肝之阳气及脾之阴气，具有散肝除风、和脾止血的功效[17]。现代药理研究表明，松花粉具有抗氧化、促进细胞增殖与伤口愈合、调节免疫、抗化学性肝损伤等功效。为了除去松花粉中携带的微生物，本实验以食品灭菌中常用的加工手段过热蒸汽灭菌法为灭菌方法进行处理。其基本原理依据是常用的加热杀菌法食品工艺技术，在加压的情况下，对饱和蒸汽再进行加热以后形成的水蒸气，在一定的设备设施中与待灭菌物料接触，从而达到物料灭菌的效果，并避免物料结块、风味损失等一系列问题。过热蒸汽灭菌法可用于香味料、荞麦粉、可可豆和谷类等的灭菌处理。大量实验表明，过热蒸汽不仅杀菌效果好，而且热敏性物质的保存率较高。例如，高速搅拌式过热蒸汽杀菌法用于小麦粉等的杀菌[22]，能有效降低小麦粉中微生物含量，并且能较好维持小麦粉结构特性，颗粒形态完整，双折射强度几乎没有变化；塔式过热蒸汽杀菌法也常被用于处理冷冻干燥蔬菜制品，能最大限度地保存色、香、味及其营养成分[23]。

食品安全关系民生，食品安全性毒理学评价是食品安全食用与开发的前提。松花粉作为重要的食用药用资源及中药保健食品的开发原料，对其产品的安全性毒理学评价显得尤为重要。本研究表明，过热蒸汽灭菌松花粉最大给药剂量达10 g·(kg·BW)-1下，未见动物有中毒症状和死亡，急性经口毒性属于实际无毒级。细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、小鼠精子畸形3项遗传毒性组合试验结果均为阴性，表明过热蒸汽灭菌松花粉无致突变作用。28 d经口毒性试验 结果表明，动物生长发育正常，体重持续增长正常，行为无异常，无中毒及死亡症状，血常规和血液生化等指标等均未受明显影响，且经组织病理学检查均未见与受试物作用有关的病理学改变，提示该过热蒸汽灭菌松花粉未见毒性作用。

综上所述，上述试验结果均表明过热蒸汽灭菌松花粉并无明显毒性作用，安全性较高。本研究可为松花粉灭菌工艺优选以及松花粉的进一步开发利用提供一定依据。