鸡坏死性肠炎诊断技术

张 艳 冯万宇 薛沾枚 刘雪松 张 备 徐 馨 张国华 吴 宪 王 岩 史同瑞

黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院 黑龙江齐齐哈尔 161005

鸡坏死性肠炎属于“肠毒血症” 的一种表现类型，主要由A 型和部分C 型产气荚膜梭菌引起。 由英国学者Parish 在1961 年首次报道，随后Parish 制备动物模型， 成功用产气荚膜梭菌人工复制出鸡坏死性肠炎， 随后鸡坏死性肠炎在全世界其他国家的养禽场所相继报道， 对全世界养禽业产生了巨大冲击[1]。 据报道，全球每年因坏死性肠炎暴发造成的经济损失可达20 多亿美元[2]。

长期以来， 全球的养殖业对疾病的应对措施依赖于抗生素的使用， 在集约化饲养中向畜禽基础日粮中添加低剂量的抗生素较为普遍， 因为其低成本的投入即可促进动物增重、降低发病率和病死率，为从业者带来丰厚的经济收益[3]。 但是，长期的抗生素使用使动物体内产生了一些对抗生素抗性较强的耐药菌株， 并且在相关动物制品及废弃物中也检测到了抗生素，严重危害了公共生态安全和食品安全[4]。所以，欧盟在2006 年对此立法，禁止向动物饲料中添加抗生素，随之而来是畜禽的发病率显著升高，其中，禽坏死性肠炎发病率增高明显，对全球养禽业产生了巨大冲击[5]。 所以，鸡坏死性肠炎的早期诊断变得尤为重要。该文对坏死性肠炎诊断技术进行详述，以期及早发现该病并采取相应诊治措施。

1 病 原

坏死性肠炎是1961 年在英国首次发现的一种禽类肠道疾病，A 型产气荚膜梭菌是坏死性肠炎的主要致病菌，其次为C 型产气荚膜梭菌[1]。 产气荚膜梭菌又称为魏氏梭菌， 是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，是人和动物肠道的常在菌，分为A、B、C、D 和E 等5 个型。 产气荚膜梭菌在繁殖过程中能产生多种具有致病作用的外毒素和酶，目前发现的有ɑ、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν 和NetB 毒素以及许多透明质酸酶和唾液酸酶等， 其中ɑ、β、ε 和ι 是主要的致死毒素[6]。 产气荚膜梭菌在动物健康情况下栖息于嗉囊、小肠和盲肠中，不会引起机体发病，当肠黏膜受损或肠道菌群失调时，会在消化道前段大量增殖，导致坏死性肠炎的发生和鸡只死亡[7]。

2 流行病学

该病一年四季都可发生， 在潮湿闷热的夏秋季节发生较多。 传染源是患鸡及隐性感染鸡。 以2~5 周龄，特别是3 周龄肉鸡最易感。 5 周龄以上蛋鸡易感。平养鸡比笼养鸡更易感。一般经消化道传播，也可垂直传播[8]。

3 临床症状

3.1 临床型 以突然发病、急性死亡为特征，多数未表现任何临床症状在1~3 d 死亡。

3.2 亚临床型 病死率较低， 主要表现为食欲减退、腹泻、肛周常黏有粪便等污物、生长缓慢，料重比增高、生产性能下降，常引起其他病原的继发感染。

3.3 慢性型 患鸡偏瘦，精神沉郁，羽毛杂乱，食欲减退，畏寒扎堆，双翅低垂，运动失调，有的患鸡还表现嗉囊肿胀，有的腹泻，粪便带血或呈黑褐色煤焦油样，偶见粪便中混有肠组织黏膜，生长发育迟缓。

4 剖检病变

剖开病死鸡的腹腔，可闻到明显的尸腐臭味。小肠病变最为典型，尤其表现在空肠、回肠，肠管扩张、臌气导致明显增粗， 体积约是正常肠管的2~3 倍。肠黏膜变厚，肠腔内含带鲜血的黄褐色至发黑稀便，肠壁明显充血，可见出血点。肠黏膜上有大小和形状各异的麸皮样坏死斑， 病情严重时可见肠黏膜上形成坏死性伪膜，易剥离，肠管弹性丧失、易断。有时可见肝脏、胆管肿大，在肝脏表面有灰黄色坏死灶，有时有黄豆粒大小的多发性囊肿。 肿大的胆管内可见大量黏稠胆汁。

5 病原学诊断

5.1 病料采集 病料的采集方法按NY/T 541 的规定进行。 病料包括小肠病变部位内容物、 体腔渗出液及各病变脏器。

5.2 病原鉴定

5.2.1 病原检测程序 按图1 所示进行。

图1 产气荚膜梭菌培养与鉴定程序图

5.2.2 细菌形态学观察

5.2.2.1 菌落特征 在鲜血琼脂培养基上， 可形成2～5 mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落，偶尔见裂叶状边缘的粗糙菌落及丝状边缘的不规则扁平菌落， 菌落周围有溶血环， 大多数菌株可产生双环溶血。 在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸 （TSC） 卵黄琼脂培养基夹层中可见周边有透明环的黑色圆菌落，有时菌落周围有气泡。

5.2.2.2 细菌形态 菌体呈直杆状、 两端钝圆，大小为（0.6～2.4）μm×（1.3～19.0）μm，单个或成双，短链很少出现，革兰氏阳性。 无鞭毛，不运动。 芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，使菌体膨胀。 多数菌株可形成荚膜，对细菌负染可见到荚膜。

5.2.3 生化试验 按GB 4789.13 的规定进行。

5.2.4 PCR 鉴定

5.2.4.1 引物序列 参考文献中提到的引物[9]。上游引物F：5′-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG-3′；下游引物R：5′-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC-3′。

5.2.4.2 模板制备 挑取可疑菌落， 加入含20 μL灭菌去离子水的PCR 离心管中， 压紧管盖， 煮沸10 min，再冰浴10 min，离心取上清液作为PCR 模板样品。

5.2.4.3 反应体系 可配制25 μL 反应体系， 具体见表1。

5.2.4.4 反应条件设置 各种试剂加样后充分混匀，4 000 r/min 离心30 s，置入PCR 仪，设置程序如下： 第1 阶段，94 ℃，2 min； 第2 阶段，94 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃延伸40 s，30 个循环； 第3 阶段，72 ℃，10 min。

表1 PCR 反应体系

5.2.4.5 凝胶电泳 PCR 产物与10×上样Buffer 混合，加样于1%琼脂糖凝胶板中，设置电压9 V/cm，20～40 min，在凝胶成像系统观察结果。

5.2.4.6 结果判定 阳性对照在402 bp 位置出现一条清晰条带， 阴性和空白对照孔不应出现任何条带；若检测样品在402 bp 位置出现条带，可确认为产气荚膜梭菌核酸检测为阳性， 无条带或条带的位置不是402 bp 的为阴性。

5.3 动物回归试验 以细菌浓度为8×109cfu/mL的分离株菌液口腔灌服21 日龄健康雏鸡，0.5 mL/羽，连续观察7 d，临床症状和剖检病变都符合后，采集病料分离培养符合接种菌的特征， 则可判为动物试验阳性。

6 综合判定

符合产气荚膜梭菌形态特征、 生化试验、PCR鉴定和动物回归试验阳性的，可确诊鸡坏死性肠炎。