鹅圆环病毒TB Green 实时荧光定量PCR 方法的建立及初步应用

赵 敏 李家玉 黄 瑜 万春和＊

（1.福建农林大学生命科学学院 福州 350002；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室 福州 350013）

鹅圆环病毒（Goose circovirus，GoCV）属于圆环病毒科 （Circoviridae） 圆环病毒属 （Circovirus）[1]。GoCV 基因组为共价闭合环状、 单股负链DNA。 目前，基因组大小有三种，分别为：1 820 nt（仅2 株，GenBank 登录号AF536939 和AF536938）、1 821 nt和1 822 nt （仅1 株，GenBank 登录号KT207809）。GoCV 基因组编码4 个大的主要开放阅读框（ORF）：V1 （nt72/73 -953）、C1 （nt1760/1761 -1008）、V2（nt1612/1613-1725）和C2（nt426/427-127）。 是无囊膜的二十面体病毒粒子，其直径约20 nm，为目前已知的最小鹅类病毒。 鹅圆环病毒首次是由德国学者Soike 在1999 年德国勃兰登南部地区一群发育迟缓的鹅中发现[2]。 随后在我国台湾[3]、浙江[4]、重庆[5]、江西[6]、山东[7]、福建[8]、广东[9]、新疆[10]等地相继被发现。GoCV 与鸭圆环病毒等圆环病毒属成员相似，GoCV是一种潜在的免疫抑制病毒， 主要感染宿主的淋巴细胞，导致宿主的免疫功能下降，生长迟缓，且增加继发感染其他病原的概率，危害极大，给鹅的养殖带来了极大的困难，同时造成了极大的经济损失，目前对于GoCV 还没有有效的治疗手段[11-12]。

由于TB Green 实时荧光定量PCR 方法具有高特异性、高敏感性、良好的重复性以及可定量等诸多优势，已成为病原检测最常用的方法之一[13]。本研究根据GenBank 中的GoCV 序列设计实时荧光定量PCR 的引物和构建载体获得阳性质粒作为标准品，以此建立鹅圆环病毒的TB Green 实时荧光定量检测方法。为鹅圆环病毒的预防提供有效的手段，同时为鹅圆环病毒核酸流行病学调查提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 毒株及临床样品 试验用鸭源鸭圆环病毒I 型（Duck circovirus type I，DuCV-I）、鸭源鸭圆环病毒II 型（Duck circovirus type II，DuCV-II）、鸭 源禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、鸭源霍乱巴氏杆菌（Pasteurella multocida，PM）、 鸭源大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli） 和 鸭 疫 里 默 氏 菌（Riemerella anatipestifer，RA） 均由本课题组鉴定和保存。

64 份鹅组织样品来自2019～2021 年广东、福建、湖北、江西和上海5 个省份（直辖市）地方水禽养殖场送检样品。

1.2 主要试剂与耗材 病毒DNA/RNA 提取试剂盒、 一步法反转录试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；细菌DNA 提取试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；PCR 扩增试剂盒Thermo Scientific Dream Taq Green PCR Master Mix 购自Thermo Fisher Scientific 公司； 实时荧光定量试剂盒TB Green Premix DimerEraser、pMD20-T vector、大肠杆菌 （Escherichia coli）DH5α，DNA Marker 分 子 量2000 均购自宝生物（TaKaRa，大连）公司；质粒小量提取试剂盒I Plasmid Mini Kit I D6943 和胶回收试剂盒Gel Extraction Kit D2500 购自Omega（美国）公司；PCR-0208-C 管购自Axygen（美国）公司。

1.3 引物的设计与合成 从NCBI 数据库获得GoCV 全长序列，利用Oligo.v7.37 引物设计软件，在保守区域设计GoCV 特异性实时荧光定量PCR 引物，上游引物GoCV-F：5′- GTTCACCGACTCGAAGGTATG-3′、下游引物GoCV-R：5′- GTCTGCGAAAGAATGCGAAAG -3′，目的片断大小为138 bp。上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 核酸的提取 利用DNA 核酸提取试剂盒提取GoCV、DuCV-I、DuCV-II； 利用细菌DNA 提取试剂盒提取PM、E. coli 和RA 核酸；利用RNA 试剂盒提取AIV 核酸RNA，利用反转录试剂盒将提取的病毒RNA 反转录成cDNA 备用。

1.5 GoCV 阳性质粒的构建 本研究的阳性标准品为阳性重组质粒 （pMD-GoCV）， 制备见参考文献[6]。 经分光光度计测定其浓度后计算出阳性质粒拷贝数为5.41×109拷贝/μL， 将该阳性质粒进行10 倍连续倍比稀释，冻存于-20 ℃备用。

1.6 反应条件优化 实时荧光定量PCR 反应体系按照TB Green 说明书配制， 反应总体积为20 μL。为确定反应的最佳引物量， 分别设置（稀释浓度为10 μmol/L）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 μL 等不同的引物量进行反应；为确定最佳退火温度，分别设置不同的退火温度（53～60 ℃）进行反应。

1.7 标准曲线的建立 以不同浓度 （5.41×104～5.41×106拷贝/μL）的pMD-GoCV 质粒为模板，利用优化后的TB Green 实时荧光定量PCR 方法的最佳反应条件，进行实时荧光定量PCR 扩增，反应后得到扩增曲线和熔解曲线。以Ct 值（循环数阈值）为纵坐标， 以标准质粒的起始拷贝数的常用对数为横坐标，绘制实时荧光定量PCR 方法的标准曲线。

1.8 敏感性试验 以不同浓度 （5.41×106～5.41×100拷贝/μL）的pMD-GoCV 质粒为模板，利用优化后的TB Green 实时荧光定量PCR 检测方法进行扩增反应， 确定该实时荧光定量PCR 方法的最低检测限。

1.9 特异性试验 以所提取的GoCV 病毒DNA 为阳性对照，对水禽常见病原（DuCV-I、DuCV-II、PM、E. coli、RA 和AIV） 利用优化后的TB Green 实时荧光定量PCR 检测方法进行扩增反应， 评价建立的GoCV 实时荧光定量PCR 检测方法的特异性。

1.10 重复性试验 以不同浓度 （5.41×102～5.41×106拷贝/μL）的pMD-GoCV 质粒为模板，利用优化后的TB Green 实时荧光定量PCR 方法的最佳反应条件进行反应，检验该方法的重复性。每个浓度的质粒做4 次重复，测定组内变异系数。将上述不同浓度的pMD-GoCV 质粒保存放置于-20 ℃，在冻存后第7 d、14 d、21 d 分别取出作为模板进行检测，测定不同批次试验的组间变异系数。

1.11 临床样品检测 对2019-2021 年广东、福建、湖北、江西和上海5 个省份（直辖市）地方水禽养殖场送检的64 份鹅组织临床样品按照常规方法处理，用病毒核酸提取试剂盒提取DNA， 利用建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法进行GoCV 感染的检测，同时用常规PCR 方法[3]检测以上样品，比较两种方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 优化后的实时荧光定量PCR 反应条件 TB Green 实时荧光定量PCR 优化的最佳反应体系（20 μL）：2 ×TB Green Mix 10 μL、 浓 度 均 为10 μmol/L 的 上 游 引 物 （GoCV-F） 和 下 游 引 物（GoCV-R）各0.6 μL、模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。 优化的TB Green 实时荧光定量PCR 方法的反应程序： 预变性，95 ℃、2 min；95 ℃、10 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 个循环结束后进行熔解曲线分析。

2.2 标准曲线的建立 通过扩增曲线可见，建立的GoCV 实时荧光定量PCR 检测方法， 扩增效率为98.0%，相关系数为1.00，当模板起始浓度在5.41×104~5.41×106拷贝/μL 时，具有很好的线性关系。 以Ct 值为纵坐标，以标准质粒起始拷贝数的常用对数为横坐标， 获得TB Green 实时荧光定量PCR 方法的标准曲线（见图1），曲线的斜率为-3.424，Y 轴截距为38.41， 表明建立的检测GoCV 的TB Green 实时荧光定量PCR 方法线性关系良好。

图1 GoCV TB Green 实时荧光定量PCR 方法的标准曲线

2.3 敏感性试验 以不同质粒浓度为模板，利用优化后的TB Green 实时荧光定量PCR 方法进行扩增反应，结果见图2，该方法最低检测限为5.41×101拷贝/μL，表明建立的方法敏感性好。

2.4 特异性试验 由扩增曲线（见图3）可知，建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法仅能扩增GoCV，对其他水禽常见病原（如鸭圆环病毒I 型、鸭圆环病毒II 型、禽流感病毒、霍乱巴氏杆菌、大肠杆菌和鸭疫里默氏菌）均不能扩增。

图2 GoCV TB Green 实时荧光定量PCR 方法敏感性

图3 GoCV TB Green 实时荧光定量PCR 的特异性

图4 GoCV TB Green 实时荧光定量PCR 的熔解曲线

通过分析熔解曲线（见图4）可知，建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法检测GoCV 仅出现1个特异的单峰，Tm=（84.46±0.09）℃，无引物二聚体，无非特异性扩增。 水禽其他常见病原（鸭圆环病毒I型、鸭圆环病毒II 型、禽流感病毒、霍乱巴氏杆菌、大肠杆菌和鸭疫里默氏菌）均无特异性扩增，表明本研究建立检测GoCV 的TB Green 实时荧光定量PCR 方法特异性强。

2.5 重复性试验 以不同浓度的标准质粒为模板，利用建立的方法进行组内和组间重复性试验， 检测结果见表1，组内重复的变异系数为0.26%~0.55%，组间重复的变异系数为0.23%~0.87%， 表明本研究建立的TB Green 实时定量PCR 方法重复性好。

表1 实时荧光定量PCR 的重复性试验

2.6 临床样品的检测 利用建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法和常规PCR 方法，同时对64 份临床送检的鹅组织病料样品进行GoCV 感染的检测，结果见表2。 常规PCR 方法只检出15 份GoCV阳性，阳性率为23.44%；建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法检出18 份GoCV 阳性， 阳性率为28.13%， 且15 份常规PCR 检测的阳性样品利用本研究建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法检测均为阳性， 与常规PCR 相比， 本研究建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法敏感性更好。

表2 临床样品的检测

3 讨 论

鹅圆环病毒属于圆环病毒属成员， 与鸭圆环病毒一样属于圆环病毒科。 该病毒感染鹅后会引起免疫功能下降， 生长迟缓， 导致病原二次感染或共感染[14]。 有研究报道，GoCV 感染宿主17~30 d 会导致腹泻、 生长迟缓和羽毛疾病， 检测发现宿主的法氏囊、胸腺、脾脏等多个组织器官被感染，其中法氏囊的病毒载量相对较多， 组织学检查显示法氏囊中的淋巴细胞减少和组织细胞增多以及以肺、 肝和肾中的淋巴浸润为特征的炎症[15]。 还发现鹅圆环病毒与多种病毒共感染，导致病死率增大[16-17]，由此可见，GoCV 对鹅养殖业危害极大。

本研究基于GoCV 保守区域建立的TB Green实时荧光定量PCR 方法具有以下优点： 特异性强，只对GoCV 进行扩增， 对其他水禽常见病原 （如GoCV、DuCV-I、DuCV-II、PM、E. coli、RA 和AIV）均不能扩增； 重复性好， 组内重复变异系数最高为0.55%，组间变异系数最高为0.87%；灵敏度高，最低检测限为5.41 拷贝/μL。 利用建立的TB Green 实时荧光定量PCR 方法和常规的PCR 方法， 同时对2019-2021 年广东、福建、湖北、江西和上海5 个省份（直辖市）地方水禽养殖场送检的64 份鹅组织临床样品进行GoCV 感染的检测，均检测到GoCV，其中使用本研究建立的TB Green 实时荧光定量PCR方法检出18 份阳性，阳性率为28.13%。前期有报道表明，来源于黑龙江、辽宁、河北、山东、河南、江苏、四川、安徽、湖南、江西和广东11 个省份的鹅组织样本的总体GoCV 阳性率为21.7%[17]。本研究对2019-2021 年广东、福建、湖北、江西和上海5 个省份（直辖市）地方水禽养殖场送检的64 份鹅组织样品的阳性率为28.13%，阳性率较高，可能与样品类型和地域不同等因素有关。