益气活血解毒方对胰腺癌晚期胰腺细胞迁移和侵袭的影响*

乔炜超，田甜，夏青，张妞

承德市第三医院，河北 承德 067000

胰腺癌是目前临床上预后极差的肿瘤之一，具有发病隐匿、分化差和高转移率等特征[1]。目前，临床上治疗该病以根治性手术切除为主，术后辅助化疗，但患者术后5年生存率仍不足20%[2]。据报道，约30%患者在术后1年内胰腺癌复发转移，30%患者在术后2年内发生肿瘤复发转移[3]，因此，研究胰腺肿瘤细胞迁移和侵袭的机制十分必要，同时也需要在化疗基础上探索新的治疗方案提高患者5年生存率。临床上胰腺癌常见化疗方案为吉西他滨+替吉奥，这种治疗方式在治疗疾病的同时也给患者免疫功能、消化系统等带来副作用，出现白细胞降低、呕吐、脱发、药物性发热、口腔溃疡等[4]。承德市第三医院拟制的益气活血解毒方可帮助患者减轻化疗后不良反应，提高患者免疫功能，但其是否能够抑制胰腺肿瘤细胞转移尚不清楚。基于此，本研究通过培养人胰腺癌细胞株及种植胰腺肿瘤的裸鼠观察益气活血解毒方对胰腺肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。

1 材料

1.1 细胞与动物人胰腺癌细胞系PANC-1(美国菌种保藏中心，目录号：HTB-52)。4周龄左右健康清洁级雌性裸鼠25只，体质量(18±2.5)g，由江苏省动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK(苏)2018-0019，实验动物饲养设施使用许可证号：SYXK(苏)2017-0003。所有裸鼠于层流架内分笼饲养，专人负责管理。实验室定期消毒，环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。饲养1周后开始实验。本研究经承德市第三医院实验动物伦理委员会批准(伦理批号：20201056)，符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

1.2 药物与试剂Trizol试剂、Transwell小室、即用型PBS粉剂、荧光定量siRNA转染试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：15596018、140644、12500096、AM1631)；细胞裂解液(美国Sigma-Aldrich公司，货号：R0278)；丝氨酸/苏氨酸激酶 30(serine/threonine kinase 30，STK30)兔多克隆抗体(美国Abcam公司，货号：ab17464)；成纤维激活蛋白β(fibroblast activating protein β，FAB-β)兔多克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司，货号：AZ050)；DMEM高糖培养基(上海微科生物技术有限公司，货号：P04-03510)；胎牛血清(美国BIOIND公司，货号：04-002-1A)；MagCellect Mouse CD4+CD25+Regulatory T Cell试剂盒(美国R&D公司，货号：MAGM208)。

1.3 仪器HT-300型电子天平(成都倍赛克仪表研究所)；BMC512-IPL型倒置显微镜(江西凤凰光学股份有限公司)；RT-2100C型全自动酶标仪(美国雷杜公司)；Touch Imager型化学发光蛋白印迹成像仪[易孛特生命科学(上海)有限公司]；DYCZ-40B型转印电泳仪、DYCZ-24A型双垂直电泳仪(北京六一仪器厂)；D2012plus型台式离心机[离心半径：10 cm，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司]；7500型实时定量PCR仪(美国ABI公司)；MAGLUMI 4000 Plu型化学发光分析仪(深圳Snibe医学工程股份有限公司)；HD-650型超净工作台(苏州净化设备仪器公司)；CytoFLEX型流式细胞仪[贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司]。

2 方法

2.1 药物制备取益气活血解毒方组方药材黄芪12 g，白术12 g，山药12 g，三棱9 g，青皮9 g，山慈菇9 g，桔梗6 g及全蝎6 g。加水浸泡后煎煮制备取滤液，煎煮2次，合并滤液，测定原液每毫升含生药2.2 g；采用0.9%生理盐水配置成浓度为3 mg·L-1、6 mg·L-1和9 mg·L-1的药液。

2.2 细胞培养采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养人胰腺癌细胞PANC-1，当细胞密度达到50%～60%时，使用siRNA对其进行转染。使用PBS对转染后细胞进行清洗后，接种到含10%胎牛血清的DMEM培养基中。取对数生长期的siRNA转染后的PANC-1细胞，调整细胞密度为5×105mL-1，接种于96孔板上，每孔0.1 mL，分为观察组、化疗组及益气活血解毒方低、中、高浓度组。观察组加入含10%胎牛血清的DMEM培养基；化疗组加入含6 mg·L-1吉西他滨与替吉奥混悬液和10%胎牛血清的DMEM培养基；益气活血解毒方低、中、高浓度组分别加入含6 mg·L-1吉西他滨与替吉奥混悬液及3 mg·L-1、6 mg·L-1和9 mg·L-1益气活血解毒方溶液和10%胎牛血清的DMEM培养基，每孔0.1 mL，培养24 h后进行迁移、侵袭实验。

2.3 动物分组、模型建立与给药25只4周龄左右健康清洁级雌性裸鼠随机分为观察组、化疗组及益气活血解毒方低、中、高浓度组，每组裸鼠于腹部皮下注射1 mL细胞密度为5×105mL-1的PANC-1细胞悬液，观察其腹部肿瘤生长状况。4周后，当裸鼠腹部出现1.0～2.0 cm肿瘤时，于其腹股沟静脉留置导管，除观察组外，其余组经导管注射1 g·L-1的吉西他滨与替吉奥混悬液，每日1次；益气活血解毒方低、中、高浓度组在此基础上，分别灌胃给予 10 g·L-1、20 g·L-1及30 g·L-1的益气活血解毒方溶液，每日1次，连续给药4周。

2.4 细胞迁移实验细胞处理同2.2，将处理过的PANC-1细胞均匀接种于Transwell小室，加入DEDM培养基，调整细胞密度为2.0×105mL-1，共12孔，分别于培养2 h、4 h、6 h时随机取4孔，吸取上室培养基，擦除表面细胞培养液，PBS清洗，将小室倒置晾干后使用0.1%的结晶紫染液染色 10 min。PBS清洗后将小室置于倒置显微镜下观察从小室外侧穿入内侧细胞数。

2.5 细胞侵袭实验细胞处理同2.2，将处理过的PANC-1细胞均匀接种于Transwell小室，上室中加入稀释后的BD基质胶，于室温下培养2 h。再加入DEDM混悬液调整细胞密度为6.0×105mL-1，分别于培养2 h、4 h、6 h时随机取4孔上室，吸取其培养基，擦除其表面细胞液，PBS清洗，将小室倒置晾干，使用0.1%的结晶紫染液染色10 min。PBS清洗后，将小室置于倒置显微镜下观察从小室外侧穿入内侧细胞数。

2.6 Western Blot检测SKT30、FAB-β蛋白表达水平选取各组对数生长期的细胞(细胞密度为2.0×105mL-1)，吸取约2 mL，用细胞裂解液进行裂解，8 000 r·min-1离心6 min，加入新的EP管中。使用标准蛋白测算蛋白样品浓度后，进行蛋白上样、电泳和转PVDF膜。洗膜后分别加入SKT30与 FAB-β 抗体(稀释比例为11 000)，4 ℃下孵育过夜。再加入二抗(稀释比例为1200)进行孵育，洗膜后，使用化学发光仪对其进行检测，并用Piclab软件分析蛋白表达量。

2.7 流式细胞仪检测裸鼠CD4+CD25+T细胞的比例使用CytoFLEX型流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞占比。裸鼠治疗前和化疗4周后，取其腹股沟静脉血，3 000 r·min-1离心5 min，取上清液；按MagCellect Mouse CD4+CD25+Regulatory T Cell试剂盒说明书操作检测血清中CD4+CD25+T的比例。

3 结果

3.1 益气活血解毒方对胰腺癌晚期肿瘤细胞迁移的影响细胞处理2 h时，各组细胞迁移能力无明显差异。细胞处理4 h时，与观察组比较，各治疗组迁移细胞数量均有所降低，其中益气活血解毒方中、高浓度组迁移细胞数量显著降低(P<0.05)。细胞处理6 h时，与观察组比较，各治疗组迁移细胞数量显著降低(P<0.05)；与化疗组比较，益气活血解毒方高浓度组迁移细胞数量明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 益气活血解毒方对胰腺癌晚期肿瘤细胞迁移的影响 个)

3.2 益气活血解毒方对胰腺癌晚期肿瘤细胞侵袭作用的影响细胞处理2 h时，各组细胞侵袭能力无明显差异。细胞处理4 h时，与观察组比较，各治疗组侵袭细胞数量均有所降低，其中益气活血解毒方中、高浓度组侵袭细胞数量显著降低(P<0.05)。细胞处理6 h时，与观察组比较，各治疗组侵袭细胞数量显著降低(P<0.05)；与化疗组比较，益气活血解毒方高浓度组侵袭细胞数量明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 益气活血解毒方对胰腺癌晚期肿瘤细胞侵袭作用的影响 个)

3.3 益气活血解毒方对胰腺癌晚期肿瘤细胞STK30、FAB-β蛋白表达水平的影响与观察组比较，各治疗组STK30、FAB-β蛋白表达水平均有所降低，其中益气活血解毒方中、高浓度组STK30、FAB-β蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表3，图1。

表3 益气活血解毒方对胰腺癌晚期肿瘤细胞STK30、FAB-β蛋白表达水平的影响

图1 STK30、FAB-β蛋白Western Blot电泳图

3.4 益气活血解毒方对胰腺癌大鼠免疫功能的影响治疗前及治疗2周后，各组大鼠血清CD4+CD25+T细胞占比无明显差异。治疗4周后，与治疗前比较，化疗组CD4+CD25+T细胞占比明显降低(P<0.05)；与观察组比较，益气活血解毒方中、高浓度组CD4+CD25+T细胞占比明显升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清CD4+CD25+T细胞占比比较

4 讨论

胰腺癌是一种分化极差的消化道肿瘤，由于胰腺解剖位置位于后腹膜，患者早期症状不明显且易被误诊。研究显示，胰腺癌的发病率和病死率逐年升高，目前，我国胰腺癌的发病率位列恶性肿瘤的第八位，胰腺癌早期诊断率仅占5%，手术切除率低，5年生存率15%～20%，局部进展期胰腺癌占30%～40%[5]，这类患者确诊后往往不具备手术指征，而化疗药物使用在提高患者5年生存率上效果不明显，这与胰腺肿瘤细胞具有低分化、高侵袭性相关。

据研究报道[6]，通过对已切除的胰腺导管癌进行病理分析发现，肿瘤细胞增殖与细胞内K-ras基因突变率异常增高及体内抑癌基因p23表达抑制相关。研究发现，炎性因子、氧化因子等在胰腺肿瘤患者切除胰腺中高表达，具体表现为间质细胞中胰腺星状细胞过度分泌血小板来源生长因子。血小板来源生长因子与肿瘤细胞表面糖蛋白结合，使得肿瘤细胞在细胞膜表面生长出伪足，并沿着该生长因子分泌路径蔓延，促进胰腺肿瘤细胞发生侵袭[7-8]。FAB-β是血小板来源生长因子在胰腺星状细胞中表达的关键激酶，因此，本次研究将其作为观察指标之一。同时据研究报道，在p23基因抑制的肿瘤细胞中，降低SKT30表达可促进肿瘤细胞凋亡[9]，且在卵巢癌及肺癌患者中，STK30表达上升都提示肿瘤细胞增殖活性增强。

常规化疗时，患者肿瘤细胞在被杀伤的过程中，正常免疫细胞同样被抑制，正常组织中免疫细胞减少，不利于清除转移肿瘤细胞，为日后肿瘤复发埋下祸根。据研究报道[10]，CD4+CD25+T细胞是非特异性应答的核心细胞，机体内数量减少会导致自身免疫病、肿瘤、感染等发生。当CD4+CD25+T细胞表达异常时，组织内M2型巨噬细胞表达下降，M2型巨噬细胞可以吞噬过量表达的炎症因子改善肿瘤微环境，并且可提交表面抗原-抗体复合物给自然杀伤细胞，趋化其到肿瘤细胞周围，发挥杀伤作用[11]。

益气活血解毒方具有通络活血、益气解毒的作用，方中白术和黄芪可以起到补气、散去郁结的作用，对脾脏大有裨益；同时三棱、桔梗可消除瘀血，通肺气，有利于消除正常胰腺组织中炎症和氧化因子，改善胰腺肿瘤微环境[12-13]。同时，益气活血解毒方中的黄芪含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷，可抑制肿瘤细胞细胞核血管生长因子的基因表达，减少该因子分泌，抑制肿瘤细胞产生迁移[14]。方中山慈菇含有杜鹃兰素Ⅰ和Ⅱ，具有抑制血管生长因子的能力，可上调间质细胞内肿瘤抑制基因B-细胞淋巴瘤因子3(B-cell lymphoma 3，Bcl-3)，激活Bcl-CXC通路，CXC趋化因子是间质细胞中趋化因子集合，其中CXCR-7是细胞膜上G蛋白偶联跨膜受体。当Bcl基因抑制时，CXCR-7表达增加，有利于肿瘤细胞向间质细胞趋化，增强肿瘤细胞侵袭作用[15-16]。

从本次研究结果可以看出，在细胞处理2 h时，各组细胞迁移能力无明显差异，而在细胞处理4 h和6 h时，胰腺癌晚期肿瘤细胞在化疗药物及益气活血解毒方作用下，其迁移细胞数量随着时间推移逐渐下降；细胞处理4 h时，益气活血解毒方中、高浓度组迁移细胞数量明显低于观察组；细胞处理6 h时，化疗组及益气活血解毒方低、中、高浓度组迁移细胞数量明显低于观察组，同时益气活血解毒方高浓度组迁移细胞数量明显低于化疗组，说明益气活血解毒方可以减弱胰腺肿瘤细胞迁移。细胞迁移又称为细胞爬行，指细胞通过感受化学信号传导，改变自身形态，如伸出伪足，发生空间上位移[17]。当肿瘤细胞迁移加速时，肿瘤细胞增殖加快。化疗药物吉西他滨和替吉奥通过杀伤肿瘤细胞抑制肿瘤细胞内线粒体上磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3Ks)能量通路，减慢高尔基体上氨基酸合成与折叠，从而使得细胞膜上膜蛋白数量减少，无法改变细胞形态[18]。血管生长因子分泌后，可升高细胞周围氧化因子浓度，改变周围氧浓度梯度，介导细胞发生迁移。在细胞处理2 h时，各组细胞侵袭能力无明显差异，而在细胞处理4 h和细胞处理6 h时胰腺癌晚期肿瘤细胞在化疗药物及益气活血解毒方作用下，其侵袭细胞数量随着时间推移逐渐下降；细胞处理4 h时，益气活血解毒方中、高浓度组侵袭细胞数量明显低于观察组；细胞处理6 h时，各治疗组侵袭细胞数量明显低于观察组，同时益气活血解毒方高浓度组侵袭细胞数量明显低于化疗组。细胞侵袭是指肿瘤细胞通过浸润到达组织间质细胞，进一步破坏周围组织和器官的过程，它是肿瘤细胞发生器官转移的必要前提。替吉奥作为一种氟尿嘧啶类似物，进入细胞后可活化成为5-氟尿嘧啶，抑制细胞核上磷酸核糖转移酶，降低DNA复制速率，减缓肿瘤细胞过度增殖[19]。分析与肿瘤细胞增殖相关蛋白发现，STK30在观察组胰腺癌晚期迁移细胞中表达较高，随着益气活血解毒方浓度升高而表达降低，其中益气活血解毒方中、高浓度组STK30表达明显低于观察组；FAB-β在观察组胰腺癌晚期侵袭细胞中表达较高，随着益气活血解毒方浓度升高而表达降低，其中益气活血解毒方中、高浓度组FAB-β表达明显低于观察组。STK30存在于人体多种细胞中，与细胞增殖相关，据研究报道，胰腺肿瘤组织中STK30表达明显高于周围正常细胞[20]。STK30的表达主要与胰腺细胞发生迁移有关，推测其可能与胰腺肿瘤细胞中K-ras基因表达相关。K-ras基因突变是胰腺细胞发生癌变的主要原因，而化疗药物吉西他滨可靶向作用于胰腺细胞细胞核上K-ras突变基因序列，但是当细胞中STK30表达上调后，可抑制吉西他滨作用于细胞核上的K-ras突变基因上游通路，阻断对胰腺肿瘤细胞的杀伤作用[21]。通过本次研究发现，益气活血解毒方可以通过降低STK30的蛋白表达，达到抑制胰腺癌迁移细胞在体内增殖的作用，推测其作用与该方中青皮有关，它富含左旋辛弗林乙酸盐和天冬氨酸、胱氨酸等，其中左旋辛弗林乙酸盐可以介导青皮中天冬氨酸与胱氨酸进入肿瘤细胞，激活内质网上蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路，生成CK-21偶联蛋白激酶，作用于细胞核STK30基因序列，抑制其表达[22]。而FAB-β主要与胰腺癌细胞侵袭有关，据报道，FAB-β 主要存在于胰腺星状细胞的细胞质中，一般处于不表达状态，只有当胰腺细胞发生炎症、损伤时，FAB-β被激活，产生FAB蛋白合成酶，生成SKD生物信号肽，分泌到胰腺间质组织中，通过旁分泌方式与胰腺肿瘤侵袭细胞接触，介导其向分泌高浓度信号肽的间质细胞侵袭[23]。此外，本研究发现，治疗4周后，化疗组CD4+CD25+T细胞占比明显低于治疗前；同时益气活血解毒方中、高浓度组大鼠血清CD4+CD25+T细胞占比明显高于化疗组，说明益气活血解毒方可以提高因化疗导致的免疫功能下降，考虑与该方中黄芪和三棱有关，黄芪中黄酮素可以促进淋巴细胞与胰腺间质细胞附着，促进调节性T细胞生成。而三棱中的棕榈酸可作用于胸腺细胞细胞膜上跨膜蛋白，阻断化疗药物进入胸腺细胞内，使其正常分泌淋巴调节因子[24]。

综上所述，益气活血解毒方可以降低胰腺癌晚期胰腺细胞的迁移和侵袭，其作用与降低胰腺癌细胞中SKT30、FAB-β的蛋白表达水平有关；同时该方可以提高化疗后胰腺癌大鼠免疫功能，可考虑进入下一步临床研究。