基于CRISPR/Cas9系统构建Slfn2基因敲除的小鼠肺癌细胞系

陈 莹，周祖平，3，邢 兵，蒲仕明，3*

(1.广西师范大学 生命科学学院, 广西 桂林 541006；2.广西高校干细胞与医药生物技术重点实验室(广西师范大学)，广西 桂林 541004；3.广西师范大学 生物医学研究中心，广西 桂林 541004)

肺癌(lung cancer)是全球范围内发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，其中近一半病例(49.9%)发生在发展中国家[1]。肺癌是全球男性最常见癌症且是男性癌症死亡的主要原因[2]。我国肺癌发病率和死亡率位居所有癌症之首，每年新发肺癌病例约78.7万例，每年因肺癌死亡例数为63.1万[3]。

Schlafen(SLFN)蛋白家族最初在小鼠细胞中被发现，该家族蛋白在一些恶性肿瘤中可以抑制癌细胞的迁移和入侵[4-6]、肿瘤锚定依赖生长[7-9]、促进癌细胞对化疗的敏感性[6，11-12]，表明SLFNs家族蛋白在肿瘤领域有可能成为一种新的治疗靶点。SLFN2作为SLFNs的关键成员，调节T细胞的活化[12-13]。刘梦伊等[14]研究表明肿瘤细胞中Slfn2基因稳定表达后，其生长增殖速度明显减缓，迁移能力也显著降低，提示Slfn2基因在抑制肿瘤发生过程中发挥重要作用。目前Slfn2基因参与肿瘤细胞活动的作用及分子机制尚不清楚，为深入研究Slfn2基因在肿瘤发生发展中的重要作用，本文利用CRISPR/Cas9技术构建Slfn2-/-LLC细胞，为开展后续机制研究的相关实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料

肺癌细胞系LLC、胚肾细胞293T购自中科院典型培养物昆明细胞库；感受态Stb13、pLenti CRISPR v2、pMD2.G、psPAX2购自武汉淼灵生物科技有限公司；质粒测序由天一辉远生物有限公司完成。

1.1.2 主要试剂

T4连接酶、Esp3I(BsmBI)酶、胎牛血清、DMEM、Agarose、单链DNA oligo与引物合成均购自Thermo Fisher Scientific；无内毒素质粒小提中量试剂盒、氨苄青霉素、嘌呤霉素、PCR mix购自天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

PCR仪器，购自Biometra公司；恒温水槽，购于上海力辰邦西仪器科技有限公司；恒温摇床，购于上海驸玛实验设备有限公司；CO2恒温培养箱，购于Thermo Fisher公司；霉菌培养箱，购于上海智城分析仪器制造有限公司；水平电泳槽、通用电泳仪、凝胶成像系统均购于Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA序列的设计

在CHOPCHOP基因编辑网站(http:∥chopchop.cbu.uib.no/)的“Mus muscμLus(mm10/GRCm38)”物种下查询Slfn2(NM_011408.1)基因“CRISPR/Cas9”的全部“Knock-down”突变位点，选取脱靶预测最低的2个sgRNA序列，并根据pLenti CRISPR v2酶切位点黏性末端序列设计oligo与之对应的黏性末端，即在正义链5′端添加CACC，反义链5′端添加AAAC(图1)。此外，sgRNA的5′端不为“G”的则额外添加“G”。

1.2.2 pLenti CRISPR-Slfn2组质粒的构建

1)oligo的退火。将合成的oligo sgRNA稀释至50 μmol/L，各取10 μL与Annealing Buffer(5×，10 μL)混合并定容至50 μL；随后加热至95 ℃后缓慢降温至25 ℃。稀释200倍后使用(50 nmol/L)。

2)sgRNA表达。载体酶切重组的酶切连接反应体系：pLenti CRISPR v2(100 ng/μL)1 μL、oligo(50 nmol/L)1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、5× DNA Ligase Reaction Buffer 4 μL、Esp3I 1 μL、10× Buffer Tango 2 μL、DTT(20 mmol/L)1 μL、ddH2O 9 μL，总体积20 μL。将20 μL反应物置于PCR仪，按程序进行酶切连接反应：37 ℃ 3 min、23 ℃ 3 min, 20个循环；37 ℃ 10 min，50 ℃ 30 s，80 ℃ 5 min，4 ℃ 无限循环。

3)重组质粒转化。将构建的质粒4 μL加入至50 μL Stb13感受态细胞中，轻微混匀后冰上孵育30 min，随后将感受态置42 ℃水浴热激90 s，并快速将其转移到冰上冰浴5 min。向每管感受态中加入500 μL LB培养基后，将其转移到37 ℃摇床培养箱(200 r/min)恒温培养1 h。

4)重组质粒鉴定。将感受态10 μL均匀涂抹到含氨苄青霉素的固体LB培养基上，并将培养皿转移到37 ℃霉菌培养箱培养12～16 h。挑取良好的菌落加入到PCR体系(含PCR mix、Primer-pLenti-F：GGTACCGAGGGCCTATTTCC，Primer-pLenti-R：ACTTTCCCAGTTTACCCCGC)中，对插入sgRNA区域的片段扩增，获取扩增片段进行电泳验证和测序验证。

1.2.3 质粒提取

将验证的菌落活化后，加入到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，置37 ℃摇床培养箱(300 r/min)培养12～16 h。质粒提取严格按照天根无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118-02)实验流程进行。提取的质粒测定浓度后待用。pMD2.G、psPAX2质粒的转化、扩大、提取均按1.2.2节方法进行。

1.2.4 慢病毒包装

首先，将pLenti CRISPR v2、pMD2.G、psPAX2按摩尔比1∶1∶1(共30 μg)加入到DMEM培养基中(最终体积为500 μL)，充分混匀制备成质粒体系；将90 μL PEI(1 g/L)加入到410 μL DMEM培养基中，充分混匀制备成转染体系。接着，两体系室温孵育5 min后，将质粒体系逐滴加入涡旋震荡的转染体系中，并室温孵育20 min。随后，经转染体系逐滴加入生长良好且细胞融合度为70%～80%的293T细胞中转染4 h。然后，去除转染体系，加入DMEM完全培养基(含体积分数为10%FBS、体积分数为1%双抗，下同)在二氧化碳培养箱(37 ℃、体积分数5%CO2，下同)培养12 h后，换新鲜的DMEM完全培养基继续培养48 h。最后，收取病毒液，并用0.45 μm过滤器过滤病毒液。病毒液经慢病毒滴度快速检测卡(购于北京博奥龙免疫技术有限公司)检测病毒滴度后待用。

1.2.5 慢病毒转染LLC细胞

将病毒液加入到生长良好、细胞融合度为30%的LLC细胞中感染48 h。随后将培养基换成含有嘌呤霉素(终浓度为4 mg/L)的DMEM完全培养基，筛选2个48 h。

1.2.6 单克隆培养

将筛选得到的LLC细胞经消化后，调整细胞浓度为1×105个/mL，用有限稀释法将细胞接种到96孔板中。待细胞贴壁后用显微镜观察含有1个细胞的培养孔，并做好标记。

1.2.7 细胞DNA提取

单克隆细胞扩大后，取部分细胞加入细胞裂解液(10 mmol/L Tris-Cl、0.1 mol/L EDTA、0.5% SDS、10 mg/L蛋白酶k)裂解2 h，加入2倍体积乙醇混匀，15 000×g离心沉淀DNA，经体积分数70%乙醇清洗2次后，加入适量ddH2O溶解DNA。

1.2.8 目的基因敲除鉴定

将提取的DNA加入到PCR体系(含PCR mix、Primer-Slfn2-F：CTGGGAAAATGGGCATCAGTG，Primer-Slfn2-R：CAGCTCCGGATTTGTGCACTT)中，对敲除区域的片段进行扩增，获取扩增片段进行电泳验证和测序验证。

2 结果

2.1 sgRNA序列设计

在CHOPCOHP网站选取脱靶率低、编辑效率较高且位于Slfn2外显子上的sgRNA位点2个(sgRNA-1：GCTCTTTGATGCGTTTTCGC，sgRNA-2：TGTGCTGTCCTGAATTCGGG)，并结合酶切位点设计和合成oligo序列(图1)。

蓝色部分为插入接头序列，红色部分为sgRNA，黑色部分为sgRNA的反向互补序列

2.2 pLenti CRISPR-Slfn2重组质粒的构建

针对Slfn2基因序列，设计2个sgRNA寡核苷酸序列，将sgRNA与pLenti CRISPR v2连接后，转化至Stb13感受态细胞中，经筛选后对PCR产物进行验证。结果表明，pLenti CRISPR v2原始质粒大小为2 374 bp，而经过构建的质粒pLenti CRISPR-Slfn2-1&2的PCR产物大小为514 bp(图2(A)、(B))。随后对pLenti CRISPR-Slfn2-1&2 PCR产物测序，结果表明，sgRNA序列已经成功结合到pLenti CRISPR v2中，pLenti CRISPR-Slfn2-1&2重组质粒构建成功(图2(C))。

图2 pLenti CRISPR-Slfn2重组质粒的验证

2.3 突变克隆筛选与鉴定

将重组质粒、pMD2.G、psPAX2转染进入293T细胞包装病毒，利用收集的病毒感染LLC细胞。经筛选后，进行单克隆培养，并对4个单克隆(Slfn2-1a、Slfn2-1b为sgRNA-1位点突变的单克隆，Slfn2-2a、Slfn2-2b为sgRNA-2位点突变的单克隆)进行PCR和测序验证。结果表明：Slfn2-ctr扩增的PCR片段大小为691 bp，Slfn2-1a、Slfn2-1b、Slfn2-2a扩增的PCR片段均无明显碱基丢失，Slfn2-2b的PCR片段有明显的碱基丢失(图3(A))。Slfn2-2a测序结果表明，在sgRNA-2剪切处出现了8个碱基丢失，造成移码突变(图3(B)、(C))。Slfn2-2b测序结果表明，在sgRNA-2剪切处出现了180个碱基丢失，造成60个氨基酸的丢失突变(图3(D)、(E))。Slfn2-1a、Slfn2-1b在sgRNA-1突变位点处出现碱基测序混乱，可能获得非纯净的单个克隆。这些结果证明利用sgRNA-2获得了2个Slfn2基因敲除LLC细胞系。

3 讨论

Liu等[6]研究发现，肿瘤细胞中Slfn2基因稳定表达后，其生长增殖速度明显减缓，迁移能力也显著降低，提示Slfn2基因在抑制肿瘤发生过程中发挥重要作用。为深入研究Slfn2在肿瘤细胞中的作用及分子机制，本文利用pLenti CRISPR v2构建的重组质粒与pMD2.G、psPAX2包装病毒，并利用病毒实现LLC细胞中Slfn2的敲除，构建Slfn2-/-LLC细胞用于后续研究。

Slfn2共5 567 bp，含有2个外显子，共379个氨基酸，其中第2个外显子含362个氨基酸，突变位点的选择位于第2个外显子上。经筛选后，获得sgRNA-1、sgRNA-2这2个不同突变位点的SgRNA，其中CHOPCHOP网站预测突变效率sgRNA-1为48.11%，sgRNA-2为67.27%。在实验获取的单克隆中，sgRNA-1的单克隆并没有获得单一的细胞突变，测序后突变位点处序列混乱，可能是制备单克隆后实现的部分细胞突变；而突变效率较高的sgRNA-2的单克隆获得单一的细胞突变。sgRNA-2获得的2个单克隆中，Slfn2-2a剪切处出现了8个碱基丢失。8个碱基的缺失不仅仅丢失了2个氨基酸，更重要的是实现突变位点后外显子的移码突变(图3(B)、(C))。Slfn2-2b在剪切处出现了180个碱基丢失，造成60个氨基酸的缺失突变(图3(D)、(E))。此外，sgRNA-1位于第2个外显子的下游，形成的移码突变区域小，而sgRNA-2位于第2个外显子的上游，形成的移码突变Slfn2-2a剪区域较大。

4 结语

本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，实现Slfn2基因在LLC细胞中的敲除，并获得移码突变和60个氨基酸序列缺失的Slfn2-/-LLC细胞各1株，为后续深入研究Slfn2在肿瘤细胞中的作用及分子机制提供稳定的研究对象。