利奈唑胺耐药凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因和菌种同源性及感染危险因素

王翠翠，范会，金炎，邵春红，王丽萍

1 山东第一医科大学附属省立医院医务部，济南 250021；2 山东第一医科大学附属省立医院临床医学检验部；3 山东大学附属公共卫生临床中心汉光微生物实验室

凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase-Negative Staphylococcus，CoNS）是条件致病菌，近年来，随着开放性治疗手段的应用和免疫抑制剂等大量使用，CoNS 已经成为医院获得性感染的重要病原菌［1］。利奈唑胺（Linezolid）是恶唑烷酮类抗菌药物，对革兰阳性菌有广谱的抗菌疗效，主要用于治疗多重耐药菌引起的感染或其他治疗方式失败的复杂感染［2］。目前，国内CoNS 对利奈唑胺的耐药率处于较低的水平，但呈逐年上升趋势。中国细菌耐药监测网数据［3］显示，2007 年—2018 年，CoNS 对利奈唑胺的非敏感率从0%已升高至0.5%。本研究观察了45株利奈唑胺耐药凝固酶阴性葡萄球菌（Linezolid resistance coagulase-negative staphylococci，LRCoNS）的耐药基因、同源性，并分析发生LRCoNS 感染的危险因素，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 菌株、试剂及仪器 2018—2020 年山东省内110 家三级综合医院临床分离的LRCoNS 菌株45株，去除同一患者的重复菌株，其中头状葡萄球菌24株、表皮葡萄球菌14株、科氏葡萄球菌6株、阿尔莱特葡萄球菌1株。按照1：2 的比例随机抽取山东第一医科大学附属省立医院临床微生物检验科检出的利奈唑胺敏感凝固酶阴性葡萄球菌（linezolid-sensitive coagulase-negative Staphylococcus，LSCoNS）菌株90株，去除同一患者的重复菌株。VITEK MS全自动快速微生物质谱分析仪购自法国梅里埃生物有限公司，VITEK 2 Compact 全自动微生物分析仪及配套药敏卡（AST-GN67）购自法国梅里埃生物有限公司，TC-96PCR 仪购自杭州博日科技有限公司，Power Pac Basi 电泳仪购自美国BIO-RAD公司，Tanon 2500R 凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司，血平板、MH 平板、E-test 条购自OXOID 公司，DNA 提取试剂、琼脂糖凝胶、DNA 聚合酶、核酸染料Gel Red 购自上海生物科技有限公司。

1.2 45株LRCoNS的耐药基因、同源性观察

1.2.1 45株LRCoNS 的药敏试验 采用药敏试验。取临床分离的LRCoNS 菌株，采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪进行药敏试验，药敏结果参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2019 年版标准进行判读。

1.2.2 45株LRCoNS 的耐药基因观察 取临床分离的LRCoNS 菌株，采用百泰克试剂盒提取模板DNA，委托上海生工生物有限公司合成引物，参照文献［4］进行PCR 扩增，扩增产物送上海生工生物有限公司进行基因测序，在NCBI 网站上运用BLAST 比对确定其耐药基因型，包括cfr 基因、optrA 基因、23S rRNA 基因第V 功能区突变、核糖体蛋白L3 基因位点突变、核糖体蛋白L4 基因位点突变。

1.2.3 45株LRCoNS 的菌种同源性观察 采用脉冲场凝胶电泳实验。取临床分离的LRCoNS 菌株和标准菌株沙门菌H9812 包埋在胶块中，用溶菌酶和溶葡萄球菌酶裂解菌株，用限制性内切酶SmaI 和XbaI 分别消化后进行脉冲场凝胶电泳，使用BioNumerics 软件对电泳图谱做同源性分析，结果按照Tenover标准［5］进行判断。

1.3 LRCoNS 感染的危险因素分析 收集45例LRCoNS 感染患者和90 例LSCoNS 感染患者的年龄、住院时间、性别、ICU住院史、是否外院转入、近6个月手术史、是否气管插管、是否内置引流管、合并糖尿病、合并高血压、合并冠心病、合并恶性肿瘤、合并肺部感染、合并肝胆疾病、合并脑梗死、合并多重感染、利奈唑胺用药史、糖肽类用药史、碳青霉烯类用药史、抗真菌药物用药史等临床资料，采用多因素logistic 回归分析法分析发生LRCoNS感染的危险因素。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，比较用t检验；计数资料比较用χ2检验。采用多因素Logistic 回归分析法分析发生LRCoNS感染的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 45株LRCoNS的耐药基因、同源性

2.1.1 45株LRCoNS 的药敏试验结果 45株LRCoNS 的药敏试验结果见表1。由表1 可知，45株LRCoNS 对β 内酰胺类抗菌药物、喹诺酮类抗菌药物及克林霉素的耐药率较高，对万古霉素、替加环素、利福平、四环素敏感率较高。

表1 45株LRCoNS的药敏试验结果（%）

2.1.2 45株LRCoNS 的 耐 药 基 因 型 45株LR-CoNS 中，21株携带cfr 基因；4株携带optrA 基因；33株在23S rRNA 第V功能区不同等位基因发生突变，其中30株在23S rRNA 第V 功能区发生G2603T 突变、2株发生C2534T 突变、1株发生T2501C 突变；20株发生核糖体蛋白L3基因位点突变，包括N193S/K、D159Y、D108E、S158Y、G152D、M156T 等；4株发生核糖体蛋白L4基因位点突变；未检出多重耐药基因poxtA。45株LRCoNS 中，12株携带cfr 基因且发生23S rRNA 基因第V 功能区突变，2株同时携带cfr 基因和optrA 基因，1株菌同时检出23S rRNA 第V 功能区G2603T、T2537C 和G2416A 突变，24株发生核糖体蛋白L3 基因位点突变、核糖体蛋白L4 基因位点突变的菌株都发现了23S rRNA 基因第V 功能区突变或携带cfr基因。

2.1.3 45株LRCoNS 的菌种同源性 24株头状葡萄球菌相似度＞90%，具有很高的同源性，提示存在克隆株流行；14株表皮葡萄球菌中，13株相似度＞90%，具有很高的同源性，提示有克隆株流行，另一株与24株头状葡萄球菌相似度＞90%，具有很高的同源性；6株科氏葡萄球菌中，2株条带不清楚未纳入统计，其余4株相似度＞90%，具有很高的同源性，提示有克隆株流行。

2.2 LRCoNS 感染的危险因素 45例LRCoNS 感染者中，年龄＞60 岁34 例，住院时间＞40天19 例，男30例、女15 例，有ICU 住院史29 例，外院转入9 例，有近6个月手术史20例、有气管插管8例、有内置引流管17 例，合并糖尿病14 例、合并高血压25 例、合并冠心病25 例、合并恶性肿瘤22 例、合并肺部感染38例、合并肝胆疾病10例、合并脑梗死11例、合并多重感染30 例，有利奈唑胺用药史27 例、有糖肽类用药史6例、有碳青霉烯类用药史19例、有抗真菌药物用药史4例；90例LSCoNS 感染者中，年龄＞60岁28例，住院时间＞40天18例，男69例、女21例，有ICU 住院史36例，外院转入33例，有近6个月手术史36例、有气管插管23 例、有内置引流管19 例，合并糖尿病17例、合并高血压19例、合并冠心病17例、合并恶性肿瘤23 例、合并肺部感染50 例、合并肝胆疾病10 例、合并脑梗死10 例、合并多重感染54 例，有利奈唑胺用药史23 例、有糖肽类用药史15 例、有碳青霉烯类用药史36 例、有抗真菌药物用药史9 例；其中LRCoNS 感染者年龄＞60 岁、住院时间＞40天、有ICU 住院史、外院转入、有内置引流管、合并高血压、合并冠心病、合并恶性肿瘤、合并肺部感染、利奈唑胺用药史等资料与LSCoNS 感染者相比，P均＜0.05。多因素logistic 回归分析结果显示，年龄＞60 岁、合并恶性肿瘤、有利奈唑胺用药史是发生LRCoNS 感染的独立危险因素，见表2。

表2 LRCoNS感染的危险因素logistic回归分析结果

3 讨论

自2007 年利奈唑胺在我国上市以来，耐药菌在多地陆续被报道，数量呈明显上升趋势［4］。山东地区从2018 年开始陆续有医院分离出利奈唑胺耐药菌株，此次分析的45株LRCoNS 来自山东地区110家三级综合医院，菌株主要以头状葡萄球菌（24株，53.33%）为主，这与美国ZAAPS 监测结果不一致［6］，但与国内方芳等［7］报道一致，这表明病原菌的分布存在地域性差异。

药敏结果显示，45株LRCoNS 对实验涉及的大多数抗菌药物的耐药率均处于较高水平，对所有β内酰胺类抗菌药物和喹诺酮类抗菌药物的耐药率达100%，呈现出多重耐药性。未发现万古霉素和替加环素耐药菌株，这与之前报道的结果基本一致［8］。因此，对LRCoNS 引起的感染进行经验性治疗时可选用万古霉素或替加环素。

耐药基因型结果显示，23S rRNA 第V 功能区突变以G2603T 为主，有30株（66.67%）在此位点发生突变，其中1株同时在G2416A、T2537C 和G2603T 3个点发生突变，还有部分菌株检出C2534T、T2501C的突变。这是因为利奈唑胺结合于由细菌23S rRNA 第V功能区核苷酸组成的裂缝，结合位点几乎全部由RNA 组成，所以核苷酸的突变是造成耐药的主要机制。但本次研究结果与RAI 和崔兰卿等［9-10］研究有差异，他们发现利奈唑胺耐药最常见的耐药机制是在23S rRNA 第V 功能区发生G2576U 突变，而本次研究的45株LRCoNS 未检出该位点的突变，这可能跟菌种有关，也可能与地域差异有关。目前，G2603T突变报道的较少，早期多数在临床分离的利奈唑胺耐药表皮葡萄球菌［11］和人葡萄球菌亚种［12］中报道，且这些菌都分离自重症监护病房。2015 年周万青等［13］报道，在头状葡萄球菌中发现了G2603T靶位突变和携带多重耐药基因cfr，两种耐药机制同时存在，使该菌对多种抗菌药物产生耐药。但本研究中发现的G2603T 突变分别在头状葡萄球菌、科氏葡萄球菌和阿尔莱特葡萄球菌中检出，14株表皮葡萄球球菌均未发现G2603T 突变，而24株头状葡萄球菌均发现G2603T 突变，且其中10株（41.67%）头状葡萄球菌同时检出cfr 耐药基因。

本研究中21株（46.67%）LRCoNS 携带cfr，该基因能编码23S rRNA 甲基化酶，能干扰或者影响药物和核糖体间的结合，导致对利奈唑胺产生耐药，这可能也是本次检测携带cfr 耐药基因的21株菌中，有12株同时发现23S rRNA 第V功能区突变的原因。4株（8.89%）携带optrA，其中有2株菌同时携带cfr 耐药基因，这种同时携带两种恶唑烷酮类抗性基因的情况，将严重影响恶唑烷酮类药物在临床的使用效果，且由于同时携带cfr和optrA 多重耐药基因，导致了该菌对多种抗菌药物同时耐药，为临床的治疗增加了难度。optrA 首次被发现是在我国一株粪肠球菌临床分离株E349中，随后国外在利奈唑胺耐药肠球菌（Linezolid-Resistant Enterococcus，LRE）中也有检出，且近几年optrA的检出率逐渐增加。目前有报道在松鼠葡萄球菌［14］和解糖链球菌［15］中同时携带optrA 和cfr 耐药基因的情况。本次未发现携带poxtA 的菌株，poxtA 主要从动物来源的肠球菌中检出，临床来源的肠球菌流行情况较少［16］。尽管目前临床分离菌株中携带poxtA 基因较少，但由于该基因主要存在质粒上，能够通过接合试验实现耐药水平转移，我们需要对动物分离株加强监管，防止该耐药基因在临床的传播与流行。

本研究中有20株LRCoNS 发现核糖体蛋白L3基因位点突变，且都是较为常见的突变点，包括N193S/K、D159Y、D108E、S158Y、G152D、M156T 等。有4株LRCoNS 发现了核糖体蛋白L4 基因位点突变，且都发生了A128S 突变。本次发现的所有核糖体蛋白L3 基因位点突变、核糖体蛋白L4 基因位点突变的菌株都发现了23S rRNA 基因第V 功能区突变或携带cfr 基因，与之前报道的一致，提示核糖体蛋白L3 基因位点突变、核糖体蛋白L4 基因位点突变不能直接引起利奈唑胺抗性改变［17］。

菌种同源性分析结果显示，2018 年—2020 年山东地区分离的LRCoNS 菌株，同一菌种为同一克隆流行株，不同医院间流行的LRCoNS 存在克隆传播。虽然这些菌株来自不同地市、不同医院，可能是由于同一患者经过多次转院、同住过一个病房、由同一人员护理或者不同医院是否使用同一批耗材等原因造成，还需进一步通过流行病学调查确认。目前已收集的LRCoNS 菌株多数是来自医院的ICU 病房，这些患者身体免疫力低下，容易被细菌感染，结合耐药菌株能够在患者、医疗场所进行克隆传播的报道［18］，我们应加强对医疗环境的监测。本研究提示在山东地区持续监测利奈唑胺耐药菌株的必要性，实施感染控制措施以防止其进一步传播具有重要意义。对此，医护人员应该积极采取消毒隔离等防护措施，院感部门应继续加大感控措施和细菌耐药性监测力度，防止LRCoNS 菌株出现克隆播散。

本研究还发现，年龄＞60 岁的老年人、恶性肿瘤患者和利奈唑胺用药史是发生LRCoNS 感染的独立危险因素。老年人自身的免疫功能相对较低，而肿瘤患者由于长期体内营养摄入不足，消化和吸收系统功能障碍，造成机体免疫力下降，甚至器官功能衰竭，更容易遭受外界病原菌的侵袭，这与许多文献报道一致［19］。对45 例LRCoNS 患者病史分析发现，有27 位患者在感染前期使用过不同剂量的利奈唑胺进行抗感染治疗，其使用率已达到60%，对比LSCoNS 敏感患者病史，利奈唑胺的既往治疗史是LRCoNS 感染的独立危险因素，并且在统计变量中感染风险系数较高，警示临床应该合理使用恶唑烷酮类抗生素，以减少耐药的发生。

综上所述，45株LRCoNS 的耐药基因主要是23S rRNA 基因第V 功能区突变和cfr 基因，菌种同源性高，院感部门应根据当地流行病学调查结果，对耐药菌进行监测，及时制定相关的感控措施；医务人员应当增强院感防控意识，避免接触传播。年龄＞60 岁、合并恶性肿瘤、有利奈唑胺用药史的患者更易发生LRCoNS 感染。恶唑烷酮类抗生素作为治疗多重耐药菌引起的革兰阳性菌感染或其他治疗方式失败的复杂感染的重要选择之一，临床医生应做到合理使用，避免因滥用而导致的耐药菌的产生。