小麦面粉蛋白质量评价模型构建及蛋白质量再评价

2022-08-08晁岳恩

麦类作物学报 2022年8期

晁岳恩

(河南省农业科学院小麦研究所，河南郑州 450002)

小麦是世界上广泛种植的农作物之一，可加工成多种多样的食品。在成熟的小麦籽粒中，贮藏蛋白的含量约占籽粒干重的10%～15%[1]，其含量和类型影响着面筋的强度和粘弹性，决定了小麦面粉的最终加工用途[2-4]。

面筋蛋白主要由麦谷蛋白和醇溶蛋白组成，麦谷蛋白按分子量大小又可分成高分子量麦谷蛋白(HMW-GS)、低分子量麦谷蛋白(LMW-GS)。通常认为，HMW-GS约占小麦贮藏蛋白的10%左右，通过分子间或分子内二硫键作用形成面筋骨架，决定着面团的强度和延展性[5-7]。LMW-GS约占小麦贮藏蛋白三分之一，占麦谷蛋白的60%左右，由于其编码基因拷贝数多、分子量小、且在电泳图谱上与大量的醇溶蛋白重叠，因而有关LMW-GS及其编码基因与品质参数之间关系的报道相对较少[8]。有研究认为，LMW-GS与面团强度有密切关系[9-11]。

醇溶蛋白约占小麦贮藏蛋白的40%左右，在食品加工时，以单体蛋白形式通过非共价键作用结合到面筋中，主要影响面团的粘性和延展性。也有研究认为，醇溶蛋白也可以通过分子间二硫键结合到面筋中，进而影响面团的强度[12-14]。

小麦面粉蛋白类型复杂，由于缺乏简单可行的蛋白质量评价模型，不同蛋白类型对面粉品质的贡献难以量化比较。研究表明，面粉蛋白中的自由巯基和二硫键对面团结构及面团稳定性有重要影响[15-17]。当面粉加水揉混时，面粉蛋白质的自由巯基与分子内或分子间其他巯基相互结合，形成稳定的共价二硫键，决定着面筋的结构和特性[17-19]。因此，面团的二硫键是决定面团流变学特性及烘焙质量的关键因素[20-22]。面粉蛋白的巯基含量与面粉质量相关性是否显著、可否利用巯基含量量化蛋白与面粉质量的关系尚未有相关报道。因此，本研究拟分析面粉质量与巯基集团相关性，并构建面粉不同蛋白类型对其质量贡献的量化评价模型，为小麦面粉蛋白的研究提供参考评价工具。

1 材料与方法

1.1 材料

在2017-2018年度，11个不同品质类型的小麦品种(郑麦366、新麦26和西农979为强筋品种；周麦32、郑麦379、郑麦119、郑麦101和郑麦158为中强筋品种；矮抗58、郑麦369为中筋品种；郑麦103为中筋品种但品质接近弱筋)种植在河南省农业科学院试验基地，管理同当地大田，成熟、收获后磨粉，测定品质特性及巯基含量。

1.2 方法

1.2.1 磨粉及面粉品质指标测定

制粉：参照AACC 26-20方法，用BUHLER实验磨磨粉，根据籽粒的硬度确定润麦加水量，硬麦为16.5%，中等类型为15.5%，软质麦为 14.0%，润麦时间为16～18 h。面粉水分含量按AACC-4-15A测定。

面筋参数：用瑞典Perten公司的2200型面筋仪(Glutomatic)，按GB/T 14608-93测定小麦粉湿面筋含量及湿面筋指数。

粉质参数：用德国Brabender公司的810104型粉质仪(Farinograph)，按GB/T 14614-93测定吸水率、面团形成时间、稳定时间、弱化度等面团流变学特性参数。

1.2.2 硫及巯基含量测定

硫含量检测：称取10 mg面粉，加入200 μL浓硝酸在95 ℃下消化30 min；115 ℃下消化90 min，冷却至室温后用超纯水定容至1 mL。采用液相离子色谱仪(IC-2001; TOSOH,Japan)测定硫元素含量，阴离子标准液来自Wako Pure Chemicals(Japan),详细操作采用Maruyama的优化方法[23]。

总巯基和自由巯基含量及二硫键含量测定参考Wang等[24]的方法。三次重复。

1.3 蛋白评价模型建立及蛋白质量再评价

根据面粉特性与巯基含量的相关性，建立基于自由巯基和二硫键含量的蛋白质量评价模型。从NCBI数据库下载不同类型的面粉蛋白氨基酸序列(高、低分子量麦谷蛋白、醇溶蛋白、燕麦类似蛋白、硬度蛋白等)，巯基和二硫键含量预测使用在线程序(SCRATCH Protein Predictor：http://scratch.proteomics.ics.uci.edu)，利用评价模型对各面粉蛋白进行评分。

1.4 数据分析

使用SPSS 2.1对面粉质量与巯基含量的相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 面粉质量分析

从表1可以看出，11个品种中，郑麦158的粗蛋白含量较低(13.5%)，但面团稳定时间最长(16.5 min)，面筋指数达到第二高；周麦32的粗蛋白含量最高(19.8%)，面团稳定时间和面筋指数值处于中高位；郑麦119含有第二高的粗蛋白含量和最高湿面筋含量，其面团稳定时间和面筋指数值并不高。推测在不同小麦品种中，相对于贮藏蛋白的含量而言，贮藏蛋白的类型对面粉质量的影响更大。

2.2 巯基含量分析

由表2可知，在11个品种中，郑麦103的总硫、自由巯基和总巯基含量最低；郑麦119的硫含量最高，但自由巯基、总巯基和分子内二硫键含量均处于最低水平，推测郑麦119面粉中的半胱氨酸含量比例较低；新麦26的总巯基、分子内二硫键的含量最高，但自由巯基含量却不是最高，推测其蛋白质肽链内的半胱氨酸残基相互结合成分子内二硫键的比例较高。

2.3 巯基含量与面粉质量的相关性分析

对面粉品质和巯基含量之间的相关性进行分析，结果(表3)发现，硫含量与粗蛋白、湿面筋含量之间存在显著正相关关系，但与面团强度参数(面筋指数、稳定时间)之间无显著相关性，因此，硫元素含量不适合作为衡量面粉品质的参数。自由巯基含量与稳定时间存在极显著正相关关系，

表1 不同品种的面粉品质特性Table 1 Processing quality of various wheat cultivars

表2 不同小麦品种面粉中的巯基含量Table 2 Sulfur and sulfhydryl group contents in various cultivars

与面筋指数之间存在显著的正相关关系，所以自由巯基含量可以作为衡量面粉品质的参数。二硫键含量与面团强度重要参数稳定时间之间没有显著相关性，建议作为补充参数使用。综上所述，可以建立如下衡量小麦贮藏蛋白与面团强度的关系模型：

分值=0.9x+0.3y

其中，x为某个蛋白质的自由巯基数量，y为这个蛋白质的分子内二硫键数量；系数0.9取自自由巯基与面团稳定时间的相关系数近似值，0.3为分子内二硫键与面团稳定时间的相关系数近似值。

表3 小麦巯基集团与面粉品质参数的相关性分析Table 3 Correlations between flour processing quality parameters,sulfur content,and sulfhydryl group content in wheat

2.4 面粉不同蛋白类型的量化评价

从NCBI数据库下载89个不同类型的面粉蛋白和1个尚未提交数据库的燕麦类似蛋白，利用在线软件预测其分子内二硫键以及自由巯基含量。根据软件分析原理，分子内二硫键和自由巯基分属两个独立的预测。因此，当一个蛋白预测无分子内二硫键时，其半胱氨酸数量全部视为自由巯基数量；预测含有分子内二硫键时，总半胱氨酸数量减去形成二硫键的半胱氨酸数量，剩余的半胱氨酸数量即为自由巯基数量。相关面粉蛋白的自由巯基、二硫键及评估分值见表4。

表4 基于在线巯基预测结果的面粉蛋白质量评价Table 4 Predicted number of disulfide bonds in GSPs and evaluation scores calculated in this study

(续表4 Continued table 4)

在被评估的24个高分子麦谷蛋白中，评分最高的是6.3分的1Dy10.1亚基，其次为Dx5和 1Dy3(4.5分)，11个亚基得到3.6的评分，另有7个亚基得分1.8分。从面团强度贡献方面分析，1Dy10.1、Dx5和1Dy3可以认定为优质亚基，11个3.6分的属中等类型亚基，7个得分仅1.8可以看做是劣质亚基。

在36个低分子麦谷蛋白亚基中，Glu-B3和Glu-D3位点编码的蛋白得分均达到7.2分，超过了得分最高的高分子麦谷蛋白1Dy10.1亚基，但Glu-A3的12个亚基里面，仅有3个亚基评分达到7.2分，其余评分均没有超过3.6分。表明Glu-B3和Glu-D3位点的编码蛋白对面团强度贡献较大。

在所评估的27个醇溶蛋白中，4个ω-醇溶蛋白由于缺乏半胱氨酸残基，不能形成分子内或分子间二硫键，评分为0；6个γ-醇溶蛋白中，有3个评分达到7.2及以上；2个δ-醇溶蛋白中有一个评分也达到了7.2分；3个γ-黑麦类似的醇溶蛋白(gamma secalin)都在8分以上，表明这类型的醇溶蛋白对面团强度有较大贡献；12个被评估的α-或α/β-类醇溶蛋白中，有3个评分达到5.4分，超过了大多数高分子麦谷蛋白的分值。

除上述麦谷蛋白和醇溶蛋白外，重新评估了两个燕麦类似(avenin-like)蛋白和两个硬度相关蛋白(puroindoline)。在燕麦类似蛋白中，一个B型的蛋白得到了所有面粉蛋白的最高分(16.2分)，另一个A型的也获得了与普通高分子麦谷蛋白相似的3.6分。

3 讨论

面团稳定时间和面筋指数是衡量面团强度的常用指标。本研究结果显示，自由巯基含量与面团稳定时间存在极显著正相关关系，且自由巯基含量与面筋指数之间存在显著的正相关关系(表3)；分子内二硫键的含量与面团稳定时间存在正相关关系。很多研究已证实，自由巯基在面粉质量中具有重要作用[15-19]。因此，依托这两个系数构建蛋白分析模型在理论上是可行的，但模型评估结果的正确性依赖于自由巯基预测的准确性，以及该蛋白在总面粉蛋白含量中的比例。

在高分子麦谷蛋白类型中，相关研究已证实，Dx5、Dy10亚基属于优质亚基，对面团强度的贡献较大[25]。而基于模型评价的分值也表明，1Dy10.1和Dx5亚基得分较高，可以认定为优质亚基；另一个得分较高的亚基是1Dy3，分值和Dx5同为3.6分，可以认定为优质亚基。高分子麦谷蛋白含量约占面粉蛋白总量的7%～15%，可以解释45%～70%的面粉及终端应用特性[6-7]，但从本模型的评分结果看，高分子麦谷蛋白难以达到45%～70%强度贡献值。

低分子麦谷蛋白含量约占面粉总蛋白的33%、麦谷蛋白总量的60%[8]，并且在3个编码位点中，Glu-B3、Glu-D3位点编码蛋白得分均达到7.2分，Glu-A3位点也有少部分蛋白评分为7.2分。虽然传统观点认为，高分子麦谷蛋白对面团强度的贡献最大，但根据本研究的评估结果以及低分子麦谷蛋白占总蛋白含量的比例推测，低分子麦谷蛋白在面团强度方面的贡献可能更大。已有研究认为，低分子量麦谷蛋白在面团强度方面具有重要作用[9-11，26-27]。我们在品质育种过程中也发现，高分子麦谷蛋白亚基组合完全相同的品种，其面团强度指标也会有很大差异，推测高分子麦谷蛋白并不是面团强度的主要决定者。例如，本研究中的郑麦369、郑麦119和郑麦158的亲本之一都是郑麦366，蛋白电泳显示这四个品种的高分子麦谷蛋白亚基组合完全一样，但面粉质量有很大差异(表1)。

在线预测结果表明，醇溶蛋白并不像传统观点认为的缺乏自由巯基，仅靠非共价键结合到面筋中，对面筋强度没有贡献；除ω-醇溶蛋白类型以外，在其他种类的醇溶蛋白中如γ类、α(α/β)类以及黑麦类似的醇溶蛋白，对于面团强度也有贡献，这也与传统观点认为的、醇溶蛋白主要以非共价结合的方式填充到面筋骨架中不同。也有部分部分研究认为，醇溶蛋白中含有半胱氨酸残基，有可能以分子间二硫键的形式结合到面筋中[13-14，28-29]。

依据本模型评分结果，分值最高的蛋白为B型燕麦类似蛋白(16.2分)，证实了燕麦类似类蛋白与面粉品质特性有密切关系[30]。我们利用转录组测序结合蛋白电泳研究发现，在郑麦366、郑麦369、郑麦158和郑麦119四个品种中，高分子麦谷蛋白亚基组合完全一致且基因表达水平无显著差异，但燕麦类似蛋白及部分醇溶蛋白的基因表达有显著差异，也暗示这两类蛋白可能与面粉质量有密切关系(结果待发表)。

因此，在今后的优质小麦育种中，除了要继续重视高分子麦谷蛋白的作用外，还要进一步加强对Glu-B3和Glu-D3位点编码蛋白、燕麦类似蛋白及部分醇溶蛋白的研究，为优质小麦育种提供技术支撑。