缓释双氯芬酸钠的透明质酸可溶性微针的制备与表征*

陈可欣，尚少梅

(北京大学 护理学院，北京 100191)

透皮给药是一种安全快捷的给药方式，但传统透皮给药方式效率低下。微针作为一种新型透皮给药的方式，通过在皮肤中形成微米级别的通道来突破皮肤屏障，从而将药物高效地递送至体内发挥药效，大大地提升给药效率。除此之外，微针还具有无痛、无创、方便给药、减少尖锐医疗废物产生等其他给药方式不具备的优点。根据功能不同，微针可大致分为5种类型，分别是实心微针、涂层微针、水凝胶微针、空心微针和可溶微针[1]。其中，可溶微针是由可生物降解的水溶性聚合物制作而成的微米长针阵列，常用于制作微针的可溶性聚合物有聚乙烯醇、右旋糖酐、壳聚糖、海藻酸钠、聚乳酸、透明质酸等[2]。可溶微针与其他几种微针相比，生物相容性好，药物的释放速率也可以通过改变微针的载体材料而调节，是目前研究的热点[3]。透明质酸是人体内源性物质，具有良好的生物相容性。以透明质酸为基质制备的微针力学性能好，可生物降解，成本低廉[4-5]。透明质酸中可加入相应药物制备成微针进行给药，但药物会释放过快，增加给药次数，降低患者的顺应性，难以维持有效的血药浓度，无法保证药物的治疗效果。基于此，笔者应用了一种可缓释药物的纳米材料b-MSNs。

在不同类型的纳米载药材料中，b-MSNs因其具有良好的生物相容性以及稳定性而受到越来越多的关注[6]。它可以调节药物释放的速度，提高药物治疗的安全性以及高效性。b-MSNs表面易修饰与功能化，其孔中可以有效地装载各类药物。且b-MSNs可降解，不会滞留在身体造成免疫反应[7]。DS是临床中常用的一类非甾体类抗炎药，可以治疗风湿性关节炎、红斑狼疮、各种手术引起的疼痛及各种原因引起的发热。口服DS最常见的不良反应是胃肠道反应[8]。通过微针递送双氯芬酸钠可以大大减少不良反应的发生。本文中，将DS包封至b-MSNs后，与HA结合制成可溶微针，探究b-MSNs的表征、生物相容性、药物缓释以及微针的制备工艺、表征、力学性能的参数，该微针可在保持良好生物相容性以及力学性能的同时缓释药物，长时间维持有效的药物浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

材料包括：透明质酸(hyaluronic acid，HA，天津希恩思生化科技有限公司)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium，DS，北京百灵威科技有限公司)、聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)、十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyl trimethyl ammonium chloride，CTAC，北京百灵威科技有限公司)、SD大鼠(斯贝福生物技术有限公司)、PRMI 1640细胞培养基(北京索莱宝科技有限公司)、Alpha MEM培养基(北京索莱宝科技有限公司)、青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)、特级胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，北京翱擎生物科技有限公司)、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，SIGMA公司)、ELISA试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)、CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)和三乙醇胺(Triethanolamine，TEA，北京百灵威科技有限公司)。

设备包括：微针模具(苏州永沁泉智能设备有限公司)、离心机(SIGMA公司)、数字测力仪(OMEGA公司)、透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM，徕卡显微系统贸易有限公司)、NanoDrop微量分光光度计和荧光分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2 b-MSNs-DS的合成步骤

将120 mL CTAC(25wt%)、0.9 g TEA和180 mL水在60 ℃条件下连续搅拌1 h。将混合溶液(5 mL TEOS和95 mL环己烷)缓慢添加到水溶液中，形成水相和有机相分层的环境。低速搅拌60 h。通过高速离心收集水相中含有CTAC的b-MSNs。将其在60 ℃的酸性甲醇溶液中均匀分散1天，以除去CTAC模板，得到b-MSNs[9]。将180 mg b-MSN、30 mg DS、30 mL PBS超声分散均匀，黑暗条件下搅拌24 h，离心分离可得b-MSNs-DS。

1.3 透明质酸微针的制作方法

6 mL去离子水中加入6 mg的b-MSN-DS，超声分散均匀，配置成b-MSN-DS溶液，称取2 g HA，分3次加入b-MSN-DS溶液中并使用涡旋震荡仪进行涡旋，静置于4 ℃冰箱中24 h，得到胶状的微针针尖溶液。用上述方法将2 g HA加入6 mL去离子水中，得到胶状的微针基底溶液。取微针针尖溶液置于PDMS微针模具中，以5 500 r/min的转速离心15 min，使微针针尖溶液完全进入微针模具的针尖部分，小心刮除微针基底部的微针针尖溶液，将微针基底溶液置入PDMS微针模具中，以5 500 r/min的转速离心10 min，去除溶液中气泡制备出b-MSN-DS透明质酸微针。使用相同的工艺制备含有等量药物的DS透明质酸微针。制备微针的具体工艺如图1所示。

1.4 试验方法

将微针以5 N的力按压在数层封口膜上1 min，计数每层封口膜的针孔个数。使用数字测力仪计算微针的受力，将微针基底部固定，针尖朝上，逐渐增加力的强度并记录针尖位移，制作力-位移曲线图，以评估微针的机械强度。使用MC3T3-E1细胞，通过CCK-8法测试b-MSN的生物相容性。将细胞以30×103个/孔的密度接种在96孔板中，使用含有10%胎牛血清的Alpha MEM培养基培养24 h，之后与不同浓度的b-MSN培养1天、3天、5天，最后加入100 μL/孔的CCK-8工作液共同孵育2 h，使用酶标仪在450 nm处记录吸光度，将所得数值与控制组进行对比得出细胞活性，每组设定3个复孔。将巨噬细胞以10×103个/mL的密度铺于6孔板中，24 h后吸走原有培养基，加入含有5 μg/mL LPS的培养基刺激巨噬细胞活化，8 h后加入b-MSN、b-MSN-DS、DS，使用ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤测试每组的抗炎效果。使用PBS配置0.01～0.05 mg/mL的双氯芬酸钠溶液，使用微量分光光度计测试DS溶液的吸光度。选取276 nm处的数据进行计算，得到DS溶液的吸收-浓度标准曲线。为验证b-MSN-DS透明质酸微针的缓释效果，将制备好的载药材料与2 mL PBS置于透析袋内密封于透析袋中，将透析袋置入98 mL的PBS中，在37 ℃条件下置于摇床中恒温震荡，用来模拟体外药物释放。用微量分光光度计测定样品不同时间点的样品的吸光度，根据标准曲线测定药物含量并绘制释药曲线。为检测b-MSN-DS透明质酸微针有无刺入皮肤，进行离体皮肤刺入试验，具体试验步骤为：将大鼠麻醉后，用剃毛器除去背部毛发，使用外科手术刀取下大鼠背部完整的全层皮肤。除去多余的皮下组织后用异丙醇擦拭皮肤的真皮侧，去除粘附在皮下的残留脂肪。随后，使用PBS反复清洗皮肤，之后用纱布擦干。将微针以5 N的力按压在取下的大鼠皮肤上5 min后放置在固定液中进行脱水包埋，将包埋好的皮肤组织进行切片，切片的厚度为5 μm。将切好的皮肤组织进行脱蜡后再进行苏木素-伊红染色(HE染色)。

2 结果与讨论

2.1 b-MSN及b-MSN-DS表征

通过TEM对b-MSN及b-MSN-DS进行了表征，透射电子显微镜图片如图2所示。图2a中显示b-MSN呈均匀的球形，具有有序的介孔结构；图2b显示b-MSN负载DS后，纳米粒子的形态变化不大，这是由于药物进入介孔，没有影响b-MSN的球形结构。

2.2 微针表征

所制备的微针阵列为直径17.5 mm的圆形，每片微针针尖个数为358，针尖距离为700 μm，针尖高度为500 μm。微针的表征如图3所示，图3a为微距摄像机下的b-MSN-DS透明质酸微针；图3b为扫描电子显微镜下的微针针尖，扫描电子显微镜下显示微针针尖分布均匀；图3c为扫描电子显微镜下的单个微针针尖，针尖呈锥形。微针的表征显示微针充分填满了PDMS微针模具，形成针尖尖锐、分布均匀的微针。

2.3 微针机械强度测试

纯透明质酸微针和b-MSN透明质酸微针的力-位移曲线(见图4a)变化不大，且刺破前三层封口膜的针尖个数一致(见图4b)，说明b-MSN对微针的机械强度影响不大。力-位移曲线图显示，随着施加的力逐渐增大，直到单个针尖受力为0.25 N之前，微针的位移变化不大，说明微针针尖未被破坏。该微针针尖个数为358，共能承受89.5 N的力。相关文献显示单个微针针尖刺破皮肤所需的力大于0.058 N即可[10]。所以该微针完全可以刺破皮肤。

2.4 生物相容性试验

透明质酸是通过美国食品药监局审核的一种安全的材料，有多种临床用途，可以保水、润滑、促进修复等。DS也是临床上常用的解热镇痛药物，其用药量与安全性已经过相关检验。所以笔者检测了b-MSN的生物相容性(见图5)，经过CCK-8检测，不同浓度梯度的b-MSN与MC3T3-E1细胞孵育24 h后与未加b-MSN的对照组相比，细胞活性均在85%以上，b-MSN与细胞孵育1天、3天、5天后，细胞活性也没有明显的下降。说明b-MSN材料安全性高，对细胞生长没有明显的影响。

2.5 抗炎试验

LPS可以刺激巨噬细胞产生炎症因子，如IL-1β、IL-6，导致组织产生炎症反应[11]。DS可以通过调节IL-1β、IL-6的表达来抑制炎症。将b-MSN、b-MSN-DS、DS和LPS诱导活化的巨噬细胞共同孵育，使用ELISA试剂盒测定每组巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6的多少，每组重复3次。b-MSN抗炎效果如图6所示，图6显示LPS刺激后，IL-1β、IL-6分泌明显增加，b-MSN-DS组和DS组有抑制炎症的效果且b-MSN-DS组效果更明显，这可能是b-MSN-DS具有缓释作用使抗炎效果更佳。

2.6 体外药物释放试验

经计算b-MSN-DS的载药率为3.8%。b-MSN-DS透明质酸微针释药曲线(见图7)显示，药物在10 h内快速释放，随后进入相对稳定的阶段，在70 h后药物释放量才几乎没有变化。DS透明质酸微针在5 h几乎就释放完全部的药物。b-MSN-DS透明质酸微针可以达到缓释药物的效果，进而提高治疗效果，降低给药频率。

2.7 离体皮肤刺入试验

皮肤组织纵向切片后进行HE染色(见图8)，显微镜下可观察到皮肤的表皮层、真皮层和皮下组织。以5 N的力刺入皮肤5 min后，刺破角质层，形成微通道。药物可经该通道进入皮下，发挥药效。

3 结语

本文基于可溶性微针技术制备了缓释双氯芬酸钠的透明质酸可溶性微针，并对微针内部的载药材料b-MSNs-DS的表征以及微针的制备工艺、表征、生物相容性、抗炎效果、药物缓释效果、力学性能进行评价。b-MSNs-DS透明质酸微针可以缓释药物，从而较长时间内保持有效的药物浓度，解决了药物释放过快的问题。在临床医学中有广泛的应用前景。