基于GC-IMS 分析不同成熟度百香果挥发性有机物的差异

罗 杨，冯 涛，王 凯，李德俊，孟宪乐，石铭亮，王 亮,

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046；2.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；3.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明 650231；4.上海爱普香料集团股份有限公司，上海 201809）

百香果是一种西番莲科植物，大量种植于热带和亚热带地区，果汁含量极高。其果汁颜色橙黄，芳香浓郁，具有石榴、菠萝、香蕉、草莓、柠檬、芒果等10 余种水果的浓郁香味[1]。由于百香果具有独特的天然香味和丰富的营养物质，近年来越来越受到消费者喜爱，在广西、云南等地种植面积大幅增加。百香果果实在广西夏季成熟期是在开花后的50～60 d[2]，Araújo 等[3]研究表明百香果只有在果实表面颜色达到50%后才能收获，以实现最佳的采后储存、适当的成熟以及特征风味和果实品质属性的发展。代良超等[4]发现百香果的成熟度对其食品品质有影响，熟果更加适于鲜食，品质最好，而较熟果则需要采摘贮藏一定时间后品质更佳。因此百香果的采摘时机对于果实的品质及贮藏十分重要，过早或者过晚采摘果实均会对果实品质和利用产生重要影响。

随着国际市场对果品品质要求的提高及食品工业对天然风味物质需求的增加，水果的风味特别是香气物质研究日益受到关注。香气成分是评价百香果果实品质的一项重要指标，可为果实采摘、贮藏、品种选育、加工、香料制备等提供参考[5]。大量研究表明果实中含有的挥发性成分很大程度上会受到其发育程度的影响。例如田竹希等[6]在玛瑙红樱桃果实不同发育阶段香气成分的研究中，分别在绿熟期、着色期、商熟期和完熟期检出79、77、45 和53 种香气物质，发育过程中相对含量最多的依次是醛类物质、醇类物质和酯类物质。徐元芬等[7]通过研究荸荠杨梅果实挥发性成分，发现在杨梅果实生长过程中，果实的挥发性成分含量随着果实的成熟而降低。焦云等[8]发现红肉桃在未成熟的果实中挥发性成分主要为醛类和醇类等，随着果实的不断成熟，醛类和醇类下降，芳樟醇含量明显升高。有报道表明不同成熟度百香果的食用品质存在一定的差异[4,9−10]，但是针对挥发性香气成分的研究目前并不多见。

水果香气物质分析中，GC-MS[11]、GC-O-MS[12]是较常用的方法。在GC-MS 或GC-O-MS 分析过程中，需要对样品进行预处理，涉及加热、蒸馏、萃取等过程，操作繁琐，消耗的样品量大，且容易造成有机溶剂残留[13]。而且这两种方法的样品预处理过程可能破坏水果原有的一些香气成分，另外前处理或检测时间过长也可能会导致测定结果不够及时和准确[14]。气相-离子迁移谱技术（GC-IMS）是一种新型分析技术，近年来被广泛应用于食品[15]、中药[16]等样品中挥发性有机物风味分析，以及环境VOCs 监测[17]、呼气医疗[18]等领域。GC-IMS 采用顶空进样分析低温常压且易挥发性成分，无需富集浓缩，检出可以最大限度的保留样品的气味，而且二次分离得三维数据，可实现风味物质可视化。与GC-MS 相比，具有数据处理省时省力，快速得到样品报告，检测方式简单且结果稳定可靠等优势，能够快速捕捉检测样品最真实的风味[19]。然而目前采用GC-IMS 分析不同成熟度百香果中挥发性有机物的研究尚未见报道。

因此，本研究利用GC-IMS 技术对百香果不同成熟度（花后50 d 果和花后60 d 果）果实进行挥发性成分分析，阐明不同成熟度百香果中的挥发性成分及其差异，以期为百香果果实的采摘时机、贮藏、品质控制及后续利用提供依据，同时也可以为其他水果的风味物质的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

百香果：A 果（无绿果），于花后60 d 采摘，果皮表面100%紫色；B 果（1/4 绿色果），于花后50 d 采摘，果皮表面75%紫色、25%绿色 广西桂平市汇鑫百香果种养专业合作社。

FlavourSpec1H1-00053 型顶空气相-离子迁移谱仪 德国G.A.S.公司；CTC CombiPAL 顶空自动进样器 瑞士 CTC Analytics AG 公司；CLOT 毛细管柱（15 m×0.25 mm×0.50 μm） 德国CS-Chromatographie Service GmbH。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 打开百香果，取百香果果籽和果汁共1.5 g，装入20 mL 顶空瓶中，50 ℃孵育15 min后进样，进行数据分析。每个样品取3 次作为平行。

1.2.2 GC-IMS 分析条件 自动顶空进样单元：进样体积200 μL；孵育时间15 min；孵育温度50 ℃；进样针温度85 ℃；孵化转速500 r/min；

气相-离子迁移谱单元：分析时间30 min；色谱柱类型为FS-SE-54-CB-1 15 m ID：0.53 mm；柱温60 ℃；载气/漂移气为N2；IMS 温度45 ℃；离子迁移管漂移器中以150 mL/min 流速吹气30 min。

气相色谱条件：以N2为载气，0～10 min 流速为2 mL/min，10～20 min 流速为10 mL/min，20～30 min流速为100 mL/min，最终流速升至150 mL/min。

1.3 数据处理

利用GC×IMS Library Search V 2.2.1 分析软件、内置NIST 数据库和IMS 数据库，对样品中挥发性风味物质进行定性分析，结合Reporter 插件、Gallery Plot 插件和Dynamic PCA 插件采用LAV（laboratory analytical viewer）对样品建立标准曲线后进行定量分析，根据指纹图谱对比，直观地比较两种成熟度不同的百香果样品之间的挥发性有机物差异。

2 结果与分析

2.1 直接比较不同成熟度百香果中的挥发性有机物差异

根据保留时间、迁移时间和峰强度，利用Reporter 软件，分别得到三维图图1 和俯视图图2。在图1 离子迁移谱图中，横坐标1.0 处红色峰为RIP 峰（反应离子峰），为反应提供质子和电子，峰的高度即峰强度。在图2 中，RIP 峰两侧，每一个点代表了一种挥发性物质，颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深代表浓度越大。由两个图可以直观地看出，不同成熟度的百香果中的挥发性物质存在差异。

图1 不同成熟度百香果中挥发性有机物的GC-IMS 三维谱图Fig.1 Three-dimensional GC-IMS spectra of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

图2 不同成熟度百香果中挥发性有机物的GC-IMS 二维谱图Fig.2 Two-dimensional GC-IMS spectra of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

为了更直观地对比这种差异，可采用GC-IMS插件中的差异模式进行对比。图3 中，选取百香果A 果的谱图作为参比，用百香果B 果的谱图扣减参比。如果二者挥发性有机物一致，则扣减后的背景为白色，而红色代表该物质的浓度高于参比，蓝色代表该物质的浓度低于参比。点的颜色深浅反映成分含量的多少，点的颜色越红，则该组分的含量越多。通过图3 可以更加明显地看出，不同成熟度的百香果中的挥发性有机物存在差异，且A 中挥发性有机物的含量总体更高。

图3 不同成熟度百香果中挥发性有机物GC-IMS二维差异对比谱图Fig.3 Comparison of differences in two dimensional GC-IMS spectra of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

2.2 不同成熟度百香果中的挥发性有机物指纹图谱对比

为了进一步明确不同成熟度的百香果中具体哪些物质存在差异，实验选取百香果A 和B 样品中所有峰进行指纹图谱对比，结果见图4。图4 中，每一行代表一个百香果样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同百香果样品中的信号峰。有一部分挥发性化合物由于具有较高浓度等原因，会形成单体（M）、二聚体（D）和多聚体（P）等不同形式，并且会出现相对应的迁移峰（图4）。从图4 中可以看到在百香果A 果和B 果的完整挥发性有机物信息以及A、B 之间挥发性有机物的差异：红框中的物质在百香果A 中的含量更高，包括DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、2-戊酮、乙酸丁酯、2-庚酮、α-蒎烯、（E,E）-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、柠檬烯、β-罗勒烯、2-丁酮、丁酸甲酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯等；黄框中的物质在百香果B 中的含量更高，包括乙酸异戊酯和乙酸异丁酯等。郭艳峰等[20]通过SPME-GCMS，对不同发育阶段的百香果果汁挥发性成分进行定性定量分析，结果发现不同发育阶段百香果果汁挥发性成分存在一定重复性，但是在某些成分上，随着果实的成熟，不同发育阶段的果实的果汁挥发性成分有着明显不同，这一结论也与本次实验结果相符。

图4 不同成熟度百香果中挥发性有机物的Gallery Plot 图Fig.4 Gallery Plot of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

通过GC-IMS 获取百香果挥发性成分的基础上，利用PCA 统计学对百香果A 果和百香果B 果进行分析，使用Dynamic PCA 插件分析结果见图5。从图5 可知，PC-1 和PC-2 的方差贡献率分别为85%和8%，累计方差贡献达93%，远大于可信值60%以上，因此PC-1 和PC-2 足以反映不同百香果样品之间的差异。在PCA 分析图中，样品之间距离近则代表差异小，距离远则代表差异明显。从图5 可以看出，同一样品三个平行组中的差异较小，而不同成熟度百香果A 和B 中的挥发性有机物存在明显差异，A 果样品主要聚集于正X 轴方向，而B果样品主要位于负X 轴方向。因此，通过GC-IMS结果结合PCA 分析，能够方便快捷地对不同百香果样品进行区分。此外，本方法也为储存和加工应用等提供一定的参考依据。

图5 不同成熟度百香果的主成分分析（PCA）图Fig.5 PCA diagrams of passion fruit with different maturity

此外，本实验采用最新指纹分析方法——“最近邻”指纹相似度，“最近邻”功能可根据所选评估区域中化合物的强度对A、B 两种成熟度的百香果样品进行快速比较（图6）。图6 中，左边红色区域和右边蓝色区域分别代表样品B 果和样品A 果挥发性物质出峰点的动态范围，每个样品进三次平行进样A1、A2、A3 和B1、B2、B3 表示每次平行试验的出峰点，顶部灰色线条代表每一针样品的相似度，出峰点越靠近灰色颜色越深，说明重复性好；越远灰色颜色越浅，说明重复性越差。从图6 可以看到B 样品的重复性比A 样品的重复性更好一些。卢健平[21]发现果实采摘后在储藏期间存在一个后熟阶段，后熟期间，水果呼吸作用旺盛，在此期间果实体内的有机物能继续水解，对风味和生理特性的变化产生莫大的影响。因此推测造成A 样品重复性不太好的原因可能是A 果为60 d 果，熟果在运输过程中生化反应更活跃，导致挥发性物质更容易发生变化[22]。但是，A 果和B 果两个样品之间的相似度低，表明两种不同成熟度的百香果之间的挥发性有机物存在明显差异。

图6 不同成熟度百香果的“最近邻”指纹分析Fig.6 "Nearest Neighbor" fingerprint analysis of passion fruit with different maturity

2.3 百香果中的挥发性有机物定性分析（GC×IMS Library Search）

在图2 中，GC-IMS 二维谱图反映了A、B 样品中每种挥发性物质迁移点。在此基础之上，结合软件内置的NIST 和IMS 数据库对挥发性成分进行定性分析，可进一步得到挥发性有机物离子迁移谱图（图7）。在图7 中，横坐标代表迁移时间，纵坐标代表保留时间，每一个点根据其对应的二维数据完成定性，一个点代表一种有机物，百香果挥发性成分定性分析结果见表1。

图7 不同成熟度百香果的挥发性成分特征峰位置点图Fig.7 Characteristic peak location point of volatile organic compounds in passion fruit with different maturity

表1 所有物质的保留指数、迁移时间和峰体积Table 1 Retention index,migration time and peak volume data of all substances

通过GC-IMS library 数据库的定性，在A、B 两种成熟度的百香果中共鉴定出33 种挥发性化合物。韩素芳等[23]利用HS-SPME-GC-MS 共鉴定出百香果中的39 种香气成分；潘葳等[24]在“满天星”百香果中共鉴定出39 种香气成分；袁源等[25]通过顶空固相微萃取方法对百香果粉进行风味分析最后测定出23 种主要挥发性化合物；刘纯友等[26]对三种类型百香果进行挥发性风味成分测定，结果共鉴定出32 种挥发性风味成分，主要包括酯类12 种、烯烃类7 种、烷烃类2 种、醇类8 种、酮类3 种，其中共有成分有16 种。在本研究中，从A 果中检测并定性出29 种挥发性化合物，其中醇类2 种，占10.44%；醛类2 种，占1.11%；酯类11 种，占79.51%；酮类2 种，占6.07%；萜烯类3 种，占2.88%（表1）。在B 果中检测并定性出15 种挥发性化合物，其中只有2 种醇类，占18.76%；8 种酯类，占81.24%。两种成熟度的百香果中酯类和醇类的含量都相对很高（表1）。本研究结果与前期采用GC-MS 报道的结果基本一致，部分差异之处可能是由于百香果品种不同的原因或者采用的分析分析仪器不同。采用GC-IMS 进行香气成分分析，可以实现挥发性物质的可视化，通过与PCA 结合则可以快速实现不同样品的区分，因此近年在食品风味分析中的受关注度越来越高。另外，本研究中尚有36 个离子迁移峰被充分分离但未被鉴定（图4），随着GC-IMS Library 数据库的日益完善，该方法在挥发性成分分析中的应用也将更加准确高效。

在有关水果香气物质的研究中，郭艳峰等[27]和Janzantti 等[28]研究发现酯类物质和醇类物质对水果的香气起到了重要作用，是主要的挥发性香气物质。此外，Porto-Figueira 等[29]发现酯类为9 种百香果鲜果挥发性物质中最主要成分，品种间挥发性化合物图谱存在差异。酯类具有果香型的感官特征，是果实中重要的特征芳香物质[30]，由脂质氧化产生的游离脂肪酸与醇之间相互作用生成[31]。Macoris 等[32]在百香果中分离检测到77 种化合物，其中以丁酸甲酯、乙酸丁酯、己醛、丁酸丁酯、反式-3-己烯乙酸酯、顺式-3-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯等酯类为主要挥发性化合物。此外，醇类通常具有清香型的感官特征[33]，百香果醇类和酯类是形成百香果独有香韵的关键物质。本研究中，百香果花后60 d 果（A 果）和花后50 d 果（B 果）中共同检测到的挥发性化合物为芳樟醇、己酸甲酯、戊酸乙酯、丙酸乙酯，酯类香气成分与上述报道结果基本一致，但是鉴定出的醇类物质数量较少，可能部分未鉴定的挥发性化合物中存在醇类物质。

Zhu 等[34]发现水果在成熟过程中风味的变化很大程度上受到乙烯的影响，研究发现造成百香果在不同阶段挥发性成分含量不同的原因在于随着果实不断发育，其体内的糖类、脂肪酸、乙烯释放量、脂氧合酶、醇脱氢酶和醇酰基转移酶等代谢相关酶活性均会发生变化，进而对果实挥发性物质造成影响[35]。随着百香果不断成熟，糖苷键被酶水解释放出游离的挥发性成分[36]从而使得百香果成熟后香气怡人。基于本研究中的实验结果，可以看出百香果成熟果A 果中检测出的挥发性成分多于B 果，且有3 类独特的挥发性成分，为醛类、酮类、萜烯类，说明随着果实的不断成熟，其体内的醛类、酮类、萜烯类香气物质不断增多，由此可将这类化合物是否被检测出作为区别百香果果实处于何种成熟度的一种判断依据。

3 结论

百香果富含众多香气物质，研究表明百香果的果香味和甜味主要是由于其体内存在许多酯类、醛类物质。本实验利用气相-离子迁移谱技术对不同成熟度的百香果中挥发性有机物进行快速定性和差异分析，经过GC-IMS 分析后，发现在两个样品中共鉴定出33 种挥发性有机物组分，其中醇类、酯类化合物为百香果的主要挥发性成分。同时实验结果表明不同成熟度百香果中的挥发性有机物存在明显差异，成熟度更高的百香果中检测到独有的醛酮类、萜烯类化合物。实验结果表明，GC-IMS 可以作为检测百香果中挥发性成分的一种操作简单、高效且可靠的方法，成熟果中检测到独有的醛类、酮类、萜烯类物质，该结果可以作为区别不同成熟度百香果的一个判断指标，同时为百香果果实采摘、贮藏、加工等开发利用提供一定理论依据，为分析和对比其他水果的挥发性成分提供一种高效快速的检测方法。