产β-甘露聚糖酶菌株筛选及制备甘露寡糖产物分析

王佰涛，杨文玲，权淑静，雷高，李珊珊，刘德海

（河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州 450008）

β-甘露聚糖酶，又称β-1，4-D-甘露聚糖酶，是能够水解β-1，4-糖苷键的一种内切酶（Srivastava等，2017），在自然界广泛存在，特别是微生物来源居多，在细菌的芽孢杆菌属和真菌的曲霉属比较常见（Piwpankaew等，2014；vanZyl等，2010）。β-甘露聚糖酶在饲料业、食品业及植物胶降解等行业应用较多（Li等，2020；Jeon等，2019），例如，在饲料业β-甘露聚糖酶可以将饲料中的抗营养因子甘露聚糖转化为营养性更高、功能性更强的甘露寡糖（Liu等，2021），提高饲料的营养吸收率和饲喂效率（Seo等，2016）。利用其降解植物胶的功能可以水解甘露聚糖生产甘露寡糖，甘露聚糖在植物中主要存在于种子胚乳中用于储存植物多糖，多来自于豆科植物瓜尔豆提取的瓜尔豆胶（康立新等，2012）、南星科植物魔芋提取的魔芋胶（李小菊等，2013）以及豆科植物刺槐提取的刺槐豆胶等（谢静静，2013）。目前工业上甘露寡糖的制备主要是通过甘露聚糖酶解法进行（Zhang等，2021），不同来源的甘露寡糖在结构和组成上有所不同，主要与β-甘露聚糖酶的来源及所用底物单糖组成有关。在饲料业甘露寡糖能够促进动物肠道的消化吸收，调节动物肠道的微生态平衡（Giannenas等，2016），减少有害菌在肠道的定植和生长，维持有益菌的动态平衡（Chao等，2019）。此外，甘露寡糖还能提高动物机体免疫力，减少疾病的发生（吴峰洋等，2016）。通过分析国内甘露寡糖生产状况发现，工业利用酶解法制备甘露寡糖工艺尚不成熟，因此，发现新的β-甘露聚糖酶产酶菌株并应用于甘露寡糖的生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品 试验样品为在河南省济源市猪场采集的新鲜仔猪粪便。

1.1.2 主要试验仪器 上海福玛设备公司QYC2012C 控温摇床，美国Waters 公司三重四级杆质谱仪，德国Biometra 公司Thermoblock PCR扩增仪，美国Chamber KG-SX-500 高压蒸汽灭菌锅，美国Bio-Rad 公司Bio-Rad 分子成像仪，美国SORVALL RC 6PLUS 型高速冷冻离心机，德国zeiss 公司荧光显微镜，上海精宏实验设备有限公司DNP-9082 恒温培养箱等。

1.1.3 试剂 魔芋胶、瓜尔豆胶、刚果红、酵母粉、牛肉粉、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氯化镁、磷酸二氢钾等均为国产分析纯试剂；细菌DNA 提取试剂盒购自北京索莱宝公司；分子生物学试剂购自华大基因公司；API 生理生化鉴定试剂盒购自梅里埃生物公司。

1.1.4 培养基 营养琼脂培养基：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化钠5 g、琼脂18 g，pH 7.3，加蒸馏水至1000 mL，121 ℃灭菌25 min。

β-甘露聚糖酶筛选培养基：魔芋胶3 g、蛋白胨6 g、酵母粉1 g、氯化钠0.5 g、刚果红0.5 g、氯化镁0.2 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂18 g，pH 6.0，加蒸馏水至1000 mL，121 ℃灭菌25 min。

β-甘露聚糖酶产酶培养基：魔芋胶15 g、硝酸钠10 g、硫酸亚铁1 g、氯化钙1.5 g、氯化钠1.5 g，pH 7.0，加蒸馏水至1000 mL，121 ℃灭菌25 min。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 采集样品前准备无菌采样容器，采集样品时去除前部和尾部粪便，采集中部粪便样品，采集后立刻放入无菌容器中。

1.2.2 菌种筛选纯化 取河南济源猪场未满月新鲜仔猪粪便样品，称取1 g 样品用无菌水制成悬液，然后依次稀释成10-4、10-5、10-6粪便稀释液，分别吸取100 μL 涂布于β-甘露聚糖酶筛选平板上，于37 ℃恒温培养箱培养48 h，观察透明圈，选择透明圈较为明显的菌株，将产酶菌株挑出保存备用。

1.2.3 酶活力测定 将筛选得到的菌株接种于β-甘露聚糖酶产酶培养基中，37 ℃、180 r/min 培养48 h 得到发酵酶液，而后在4 ℃、12000 r/min条件离心10 min，得到上清液即为β-甘露聚糖酶，参照GB/T 36861-2018 饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力测定方法测定β-甘露聚糖酶活力。

1.2.4 外观形态鉴定 对保存的产酶菌株挑取单菌落接种营养琼脂平板进行培养，观察菌落颜色、形态、外观等，并进行革兰氏染色。

1.2.5 生理生化鉴定 利用梅里埃API 鉴定试剂盒对分离菌株进行鉴定。

1.2.5 分子生物学鉴定 利用细菌基因组提取试剂盒对目标菌株的基因组进行提取。而后进行PCR，引物序列：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反应体系50μL：ddH2O21μL，1492R 1.5 μL、27F 1.5 μL，TaqMix 酶25 μL，样菌模板DNA 1 μL。PCR 程序：94 ℃预变性4 min，96 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32 个循环，72 ℃延伸10 min。而后将PCR 产物送华大基因公司测序。将16S rDNA 序列在NCBI 官网的数据库进行BLAST 比对，构建系统发育树，进行同源性比较分析。

1.2.6 甘露寡糖的制备

1.2.6.1 底物的制备 反应底物选择魔芋胶和瓜尔豆胶两种，准确称取10 g 底物，加入800 mL pH 5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液（GB/T 36861-2018），不断搅拌并持续加热，至底物溶解完全，用pH 5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液定容为1 L，制成1%底物溶液。

1.2.6.2 粗酶液的制备 将筛选得到的菌株接种于β-甘露聚糖酶产酶培养基中，37 ℃、180 r/min培养48 h 得到发酵酶液，将发酵结束后，吸取发酵液在4 ℃、12000 r/min 条件下离心10 min，弃去沉淀，所得上清液即为β-甘露聚糖粗酶液。

1.2.6.3 甘露寡糖的制备 将酶液和底物溶液按照1：10 体积比混合，在50 ℃水浴反应12 h，得到酶解粗产物。取1 mL 酶解粗产物在12000 r/min、4 ℃条件离心10 min，吸取上清，弃去沉淀，吸取上清液0.5 mL 加入0.5 mL 50%乙醇溶液混匀，在12000 r/min、4 ℃条件离心10 min，吸取上清，弃去沉淀，得到甘露寡糖溶液。

1.2.6.4 甘露寡糖产物分析 甘露寡糖的产物分析采用三重四级杆质谱仪对甘露寡糖成分进行分析。电离模式：电喷雾电离正离子模式，毛细管电压：3.0 Kv，锥孔电压：15 V，源温度：120 ℃，脱溶剂气温度：400 ℃，脱溶剂气流速：560 L/h。上述步骤中得到的甘露寡糖溶液吸取0.5 mL 加入0.5 mL Milli-Q 超纯水混匀备用上样分析。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果 从河南济源市猪场仔猪粪便中分离得到一株产β-甘露聚糖酶的菌株，编号WBT0011，将其接种于β-甘露聚糖酶筛选培养基上，所产生的的透明圈如图1A 所示。营养琼脂平板上菌落呈白色，边缘不整齐，如图1B 所示。革兰氏染色为阳性菌，如图1C 所示。

图1 菌株外观形态

2.2 生理生化鉴定结果 利用梅里埃API 50CHB 和API ZYM 试剂盒及其他生理生化反应对目标菌株进行生理生化鉴定，结果如表1～ 表4，结果发现其能利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、熊果苷、七叶灵柠檬酸铁、水杨苷、D-海藻糖作为碳源。不能分解淀粉、纤维素，甲基红、VP 实验等结果为阳性，硝酸盐还原、亚硝酸盐还原等结果为阴性。通过API ZYM 试剂盒测定目标菌株产酶活性，结果发现其具有碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶、类脂酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、苯酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-葡萄糖苷酶活性。

表1 API 50CHB 试剂盒测定碳源利用结果

2.3 分子生物学鉴定结果 对菌株WBT0011 提取基因组后，利用通用引物27F 和1492R 对其进行PCR 扩增，扩增产物的电泳条带如图2 所示，扩增片段大小为1485 bp。通过发育树软件MEGA7.0构建系统发育进化树，如图3 所示。通过PUBMED BLAST 网站分析并与模式菌株比对，发现其与Bacillus safensis 同源性高达99.52%。结合该菌株的生理生化特征、分子生物学结果和系统发育树分析，最终鉴定该菌为沙福芽孢杆菌。

图2 PCR 产物电泳图

图3 沙福芽孢杆菌系统发育进化树

2.4 β-甘露聚糖酶活力测定 将筛选得到的菌株发酵以后取上清液，然后参照GB/T 36861-2018 饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力测定方法测得β-甘露聚糖酶活力为3.8 U/mL。

表2 氮源利用结果

表3 生化特征

表4 API ZYM 酶活性反应

2.5 甘露寡糖产物分析 对质谱结果进行分析（图4 和图5），根据峰值的质荷推测魔芋胶水解产物有二糖、三糖、六糖、七糖、十一糖，瓜尔豆胶降解产物有二糖、三糖、四糖、十糖，说明二者水解效果较好，表明筛选得到沙福芽孢杆菌菌株所产β-甘露聚糖酶酶活性较好。

图4 魔芋胶水解质谱图

图5 瓜尔豆胶水解质谱图

3 讨论

本研究从河南济源猪场的仔猪新鲜粪便中分离得到一株产β-甘露聚糖酶WBT0011，通过该菌株的生理生化特征、分子生物学结果和系统发育树分析，最终鉴定该菌为沙福芽孢杆菌。在动物日粮中添加β-甘露聚糖酶可以有效提高动物的生长性能和养分表观消化率（薛瑞婷等，2020）。β-甘露聚糖酶能够去除饲料中甘露聚糖类的抗营养因子，水解为对动物机体更加有利、饲料中应用更多的甘露寡糖（张建新等，2019）。在饲料中添加甘露寡糖能显著提高动物的抗氧化性能、生产性能，改善动物肠道微生态平衡（孙盛明等，2014）。目前利用魔芋胶、瓜尔豆胶等甘露聚糖等原料和β-甘露聚糖酶反应制备甘露寡糖生产工艺还有待优化提高，新发现的沙福芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶能够有效水解魔芋胶和瓜尔豆胶生成二糖、三糖、四糖等多种寡糖，这与尹梦雅（2014）的研究结果一致。

β-甘露聚糖酶在饲料业应用广泛，利用微生物方法制备甘露寡糖绿色环保，流程简单，甘露寡糖作为一种重要的饲料添加剂，在调节动物肠道的微生态平衡，减少有害菌在肠道的定植和生长方面表现良好。通过筛选从仔猪粪便中得到一株产β-甘露聚糖酶的沙福芽孢杆菌WBT0011，表现出较强β-甘露聚糖酶产酶活性，为以后进一步工业化生产甘露寡糖提供参考。