番鸭源鸭疫里默氏菌大环内脂类药物的耐药基因检测与分析

2022-08-06林彬彬谢碧林翁汉东王秀祯程龙飞傅光华刘荣昌林志敏

福建畜牧兽医 2022年1期

林彬彬谢碧林翁汉东王秀祯程龙飞傅光华刘荣昌林志敏＊

（1.莆田市农业科学研究所福建莆田 351144；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州 350013）

鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一种黄杆菌科里默氏菌属革兰氏阴性菌，是在世界范围内发现的禽类主要病原菌之一，其引起的高传染性和高病死率给养鸭业带来巨大的经济损失。主要感染鸭、鸡、鹅和火鸡等，并导致典型的浆膜炎和败血症，以严重的纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征。药物是防治鸭疫里默氏菌病的主要方法，但药物的广泛使用也导致了耐药性菌株的出现。

红霉素、阿奇霉素是大环内酯类药物，可逆地与细菌的50S核糖体亚单位结合，抑制肽酰基转移酶，阻止转肽作用和mRNA位移，阻断肽链延伸，从而抑制细菌蛋白质的合成[1]。目前，临床上鸭疫里默氏菌对红霉素的耐药性已越来越明显[2-4]，其药物应用效果不甚理想。细菌对大环内酯类药物产生耐药性的主要机制有四种，一是核糖体RNA的甲基化修饰，主要由红霉素核糖体甲基化酶（erm）基因编码的甲基化酶介导，使核糖体靶位点改变，导致药物与核糖体的亲和力降低而产生耐药[5]；二是核糖体RNA基因发生点突变[6]；三是大环内酯类相关的糖基转移酶和红霉素灭活酶的产生，如红霉素酯酶（ere）可以水解破坏酯内环而产生耐药[7]；四是通过外排泵将药物排出体外[8]。目前，erm基因家族有20多种基因型。有研究表明，ermF、ereD基因能引起鸭疫里默氏菌对红霉素的耐药[9-10]。本研究主要就莆田市鸭疫里默氏菌对大环内酯类药物的耐药性以及相关耐药基因的携带情况进行分析，了解其耐药水平及耐药基因流行情况，探究鸭疫里默氏菌对大环内酯类药物的耐药机制，为临床上鸭疫里默氏菌病大环内酯类药物的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 49株番鸭源鸭疫里默氏菌菌株，由本所实验室分离并保存，所有菌株均已经生化鉴定和PCR鉴定。

1.1.2 主要试剂胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、红霉素药敏纸片（药物含量15μg/片）、阿奇霉素药敏纸片（药物含量15μg/片），均购于杭州微生物试剂有限公司；新生胎牛血清，购于浙江天杭生物科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、GeneRed核酸染料、DL2000 DNA Marker，购于天根生化科技有限公司。

1.1.3 引物设计与合成根据参考文献[1,9,11]合成大环内酯类相关耐药基因ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5种，引物序列及其反应参数见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 鸭疫里默氏菌大环内酯类耐药基因引物

1.2 方法

1.2.1 药物敏感性试验根据CLSI（2018）的要求，采用K-B纸片扩散法测定菌株对大环内酯类药物（红霉素、阿奇霉素）的敏感性。取待测菌株接种于TSB液体培养基中，置37℃摇床中，160 r/min培养24 h后，用灭菌生理盐水将菌液浓度稀释到0.5个麦氏比浊度。取调整后的100μL菌液于TSA平板上并用无菌涂布棒均匀涂布，待晾干数分钟后，用无菌镊子夹取不同的药敏纸片间隔一定距离贴于TSA平板上，置5%CO2培养箱中，37℃培养24 h，观察并记录结果。

1.2.2 耐药基因的PCR扩增及序列分析根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株DNA为模板，采用PCR方法对菌株中可能存在的ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5种耐药基因进行扩增。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 25μL；上下游引物（10 uM）各1μL；DNA 2μL；补充ddH2O至终体积50μL。PCR扩增程序：96℃预变性5 min；94℃变性1 min，各自退火温度退火50 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃再延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。选取部分阳性产物送生工生物工程股份有限公司进行测序，并将所得序列在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行Blast分析。

2 结果

2.1 耐药表型结果对49株鸭疫里默氏菌菌株进行红霉素、阿奇霉素2种药物的药敏试验，结果表明（见表2），分离株对红霉素、阿奇霉素的耐药率很高，分别为100%、89.80%。

表2 菌株对大环内酯类药物的敏感性

2.2 耐药基因检测结果对49株鸭疫里默氏菌菌株进行ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5种耐药基因的PCR扩增及部分测序，测序结果在NCBI上Blast分析，结果显示，ermF基因扩增序列与GeneBank登录的基因同源性达99%以上，ereD基因扩增序列与GeneBank登录的基因同源性达98%以上，表明所扩增结果正确。

耐药基因的检测结果显示，在49株鸭疫里默氏菌菌株中共检测到2种耐药基因，分别为ermF（见图1）、ereD（见图2），检出率分别为85.71%（42/49）、91.84%（45/49），见表3。没有检测到ermA、ermB、ermC等3种耐药基因。

图1 鸭疫里默氏菌ermF耐药基因PCR电泳图

图2 鸭疫里默氏菌ereD耐药基因PCR电泳图

表3 菌株大环内酯类药物耐药基因检测结果

2.3 耐药表型与耐药基因型相关性分析 49株鸭疫里默氏菌菌株对大环内酯类的耐药表型与耐药基因型的结果比较（见表4），49株对红霉素耐药的鸭疫里默氏菌菌株中，85.71%菌株检测到ermF耐药基因，91.84%菌株检测到ereD耐药基因；44株对阿奇霉素耐药的鸭疫里默氏菌菌株中，88.64%菌株检测到ermF耐药基因，95.45%菌株检测到ereD耐药基因；均未检测到ermA、ermB、ermC等3种耐药基因。可见，鸭疫里默氏菌菌株对大环内酯类药物的耐药表型与耐药基因型的符合率比较高，在85.71%～95.45%。此外，在2株对阿奇霉素敏感的鸭疫里默氏菌菌株中检测到ereD耐药基因。

表4 49株鸭疫里默氏菌菌株大环内酯类药物耐药表型与耐药基因型结果比较

3 讨论

随着细菌耐药性的问题日益严重，其耐药性检测方法也变得至关重要。目前，临床上检测鸭疫里默氏菌耐药性的常用方法是药敏试验，主要有K-B纸片法、肉汤稀释法[1]、琼脂稀释法[12]等。K-B纸片法是应用最为广泛的一种试验方法，它操作简单，无需特殊仪器，结果易于观察。程龙飞等[2]用K-B纸片法对福建省及邻近省份423株鸭疫里默氏菌分离株进行27种抗菌药物的敏感性试验，结果表明鸭疫里默氏菌分离株对多种药物耐药性很高，45%菌株对红霉素耐药。任晓梅等[3]用K-B纸片法对广东省、山东省、江苏省46株鸭疫里默氏菌分离株进行14种抗菌药物的敏感性试验，结果表明鸭疫里默氏菌分离株呈现广谱耐药性且有一定的区域性差异，89.1%菌株对红霉素耐药。朱元军等[4]用K-B纸片法对我国南方地区120株鸭疫里默氏菌分离株进行16种抗菌药物的敏感性试验，结果表明鸭疫里默氏菌分离株中出现多重耐药菌株，十一重耐药菌株最多，75.8%菌株对红霉素耐药。本研究用K-B纸片法对莆田市49株番鸭源鸭疫里默氏菌菌株进行红霉素和阿奇霉素的敏感性试验，结果表明绝大部分菌株对红霉素和阿奇霉素耐药，耐药率达89.80%以上。总体看，目前鸭疫里默氏菌菌株对红霉素、阿奇霉素等大环内酯类药物的耐药性还是很高，临床上应注意药物的选择和使用量。

药敏试验虽然是临床上筛选敏感药物和测定细菌耐药性的有效方法，但存在测定时间长、操作复杂等缺点。而PCR技术具有时效快、灵敏度高、特异性强等优点，被广泛应用于细菌的耐药基因检测[13-15]。杨芳芳[16]应用PCR技术首次在鸭疫里默氏菌中检测到介导氨基糖苷类药物耐药的3种耐药基因和介导喹诺酮类药物低水平耐药的2种耐药基因。张亚楠[12]应用PCR技术在115株鸭疫里默氏菌菌株中检测出25种耐药基因。包涛涛等[17]应用PCR技术在6株鸭疫里默氏菌菌株中检测出10种耐药基因。本研究应用PCR技术在49株番鸭源鸭疫里默氏菌菌株中成功检测到大环内酯类药物的2种耐药基因ermF、ereD，检出率均比较高，分别为85.71%、91.84%，没有检测到ermA、ermB、ermC等3种耐药基因。

Luo等[9]从全国不同地区分离得到的31%鸭疫里默氏菌菌株中检测出ermF基因，并研究表明23S rRNA甲基转移酶基因ermF介导的核糖体RNA修饰是引起鸭疫里默氏菌对大环内酯类药物产生耐药的主要原因。邢琳琳[1]研究也发现，ermF和ereD基因与鸭疫里默氏菌菌株的红霉素抗性相关。张亚楠[12]应用PCR技术对115株鸭疫里默氏菌大环内酯类药物耐药基因检测中，发现96.5%菌株携带ermF基因，确定ermF基因是引起鸭疫里默氏菌对红霉素产生耐药性的主要原因，还从中首次检出ermB和ermC基因。本研究从49株对红霉素和44株对阿奇霉素耐药的鸭疫里默氏菌菌株中，85.71%以上菌株检测出ermF、ereD两种耐药基因，在鸭疫里默氏菌大环内酯类药物耐药基因中占主导作用。据此推测，目前莆田市鸭疫里默氏菌对大环内酯类药物耐药的主要原因是由ermF和ereD耐药基因介导的，与现有研究结果一致。此外，在2株对阿奇霉素敏感的鸭疫里默氏菌菌株中也检测到ereD耐药基因，推测其耐药基因未表达。