PK15细胞全悬浮摇瓶培养工艺初探

温灵燕 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

PK15是一株癌变的猪肾传代细胞系，中文名为猪肾上皮细胞，父母代源自1955年美国Stice提供的成年猪肾细胞PK-2a，被ATCC收藏（CCL-33）[1]。细胞具有很高的生长和增殖能力，可以无限传代。该细胞对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒等多种病毒比较敏感，已广泛应用于兽用疫苗的研究和生产[2]。传统PK15细胞培养大多是贴壁型培养，但细胞贴壁转瓶培养工艺已不能满足产业化疫苗生产需求，而且PK15细胞在贴壁培养中会出现生长不稳定的情况，反复传代过程中细胞极容易抱团，之后就可能表现出生长不良甚至不能继续传代等情况。贴壁细胞生产放大采用的细胞工厂或转瓶工艺，劳动强度大，可使用的细胞密度低，制约了规模化疫苗生产工艺发展。

全悬浮培养技术与贴壁的转瓶培养技术相比有很大优势。全悬浮培养不需要载体，不需要血清，也不需要胰酶消化培养，减少人为介入，最重要的是细胞的生长密度不受附着物限制，工艺放大更简单，只需要增加培养体积即可，能更快扩大生产规模，保证产品质量稳定性和均一性，提高劳动效率，长期使用成本低。本试验初步探讨PK15细胞全悬浮条件下在锥形瓶上的生长和产毒情况，为之后放大至反应器全悬浮培养提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒 PK15悬浮细胞株，由兆丰华生物科技（福州）有限公司自主驯化、保存；PCV2-DBN-SX07，由兆丰华生物科技（福州）有限公司提供。

1.1.2 培养基 MEM，购自壹生科公司。

1.2 仪器设备 摇床；倒置生物显微镜37XB，购自上海光学仪器一厂；台式低速离心机，购自上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂。

1.3 方法

1.3.1 健康细胞制备 复苏一支冻存密度约为0.66×106个/mL的PK15悬浮细胞，离心后，弃上清，用预热的壹生科MEM培养基轻轻吹打后全部加入至250 mL摇瓶中，摇瓶液体装量为75 mL，混匀，取样，计数，记录起始细胞密度。放置在摇床上培养，分别在24 h、48 h、72 h取样，在显微镜下观察细胞的形态，并用血球计数板计数，记录细胞密度。

1.3.2 细胞传代 细胞长至72 h时，按传代后所需要的细胞数计算出所需吸取的细胞悬液，1 000 r/min离心5 min后，弃上清，加入新鲜的悬浮培养液，放置摇瓶中混匀，取样，计数，记录起始细胞密度。于37℃CO2培养箱培养，分别在24 h、48 h、72 h取传代的细胞样品计数，在显微镜下观察细胞形态并用血球计数板计数。以此方法连续传代3次。

1.3.3 接毒试验 取一瓶生长良好的全悬浮细胞按相同的起始密度分成3个摇瓶细胞，按1%、3%、5%接毒量接种PCV2-DBN-SX07，病毒效价为106.5TCID50/mL。在72 h、96 h、120 h分别取样，观察细胞状态并留样测毒。共进行三次重复试验。

2 结 果

2.1 PK15悬浮细胞摇瓶生长状态观察试验 从图1可以看到，细胞在72 h时处于生长旺盛时期，所以本试验传代的时间选择在72 h。PK15悬浮细胞在刚复苏时生长速度比较缓慢，在0～24 h，细胞处于潜伏期，细胞数目稍有增加；24～48 h处在适应期，细胞开始慢慢适应，生长密度为起始密度的2.27倍；到72 h细胞密度达到初始密度的3.03倍（见表1）。细胞适应一代后，在24 h细胞密度达到初始密度的3.06倍，在48 h达3.62倍，到72 h为4.1倍（见表2）；细胞适应二代后，增长倍数在72 h达到了8.1倍（见表3），而且细胞状态越来越好，越来越圆润透亮。从镜下观察细胞的形态（见图2），三次培养的细胞除了在密度上有差别外，形态上差别不大，均比较圆润，光泽度佳，细胞呈单个，极少数有两个或三个的小团块，是比较理想的悬浮细胞的状态。

表1 PK15悬浮细胞第一次生长情况

表2 PK15悬浮细胞第二次生长情况

表3 PK15悬浮细胞第三次生长情况

图1 三次细胞生长折线图

图2 不同时间段细胞在显微镜下的状态

2.2 PK15悬浮细胞产毒试验 本试验按照三个接毒量（1%、3%、5%）进行比较。由第一次产毒试验结果可以看出（见表4、图3），1%接毒量的细胞产毒效价比3%和5%略高，接毒量3%比5%的产毒效价略高，收获病毒时间在72 h的效价比96 h和120 h效价高。故第一次产毒试验1%接毒量和收获时间72 h是比较好的工艺。

表4 第一次接毒的效价结果

图3 第一次接毒的效价结果折线图

从表5、图4可以看出，第二次产毒试验1%接毒量的效价比3%和5%略高，收获病毒时间也是在72 h比96 h和120 h效价高。故第二次产毒试验1%接毒量和收获时间在72 h也是比较合适的工艺。

图4 第二次接毒的效价结果折线图

表5 第二次接毒的效价结果

从表6、图5可以看出，第三次产毒试验3%接毒量的效价比1%和5%都更有优势，在72 h时1%接毒量的效价比3%和5%略低一些，但在96 h和120 h的效价都比3%和5%接毒量略高。第三次产毒试验3%接毒量和收获时间在72 h是比较合适的工艺。

图5 第三次接毒的效价结果折线图

表6 第三次接毒的效价结果

3 小结与讨论

在培养条件、接种密度合适的情况下，细胞能在比较短的时间内达到对数生长期。本试验初步探索了PK15细胞悬浮摇瓶培养和接毒工艺，结果表明：细胞接种密度在0.5×106个/mL～0.6×106个/mL，可以使PK15细胞在摇瓶上生长，且细胞在摇瓶的最适传代时间为72 h。三次接毒结果初步确定，在起始密度一样的条件下，接毒量为1%和3%都是摇瓶培养适合的接毒工艺；收获病毒时间在72 h比96 h和120 h更有优势。但是从规模化生产考虑，接种剂量的大小和收获时间的长短是重要的因素。接毒量小可以节省种毒量，收获时间短也可以缩短生产周期，故选择1%接毒量和收获病毒时间在72 h作为最适的摇瓶培养工艺方案。后期将进一步开展生物反应器大规模培养工艺研究。