膜过滤泡菜汁生物膜污染的初步分析

王玉梅，李洋，罗佳沂，栗晓静，李文，毛瑞丰*

(1.广西大学 轻工与食品工程学院，南宁 530004；2.广西民族大学 化学化工学院广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006)

泡菜是自然接种混合发酵的果蔬发酵制品[1]。泡菜汁中含有多种微生物[2]且化学成分复杂[3]，经过处理后可以作为泡菜型产品的风味剂、泡菜汁饮品、泡菜风味产品原料。泡菜汁的开发利用是解决泡菜生产产生的废水污染问题的重要途径。

随着膜技术的发展，膜过滤因具有低能耗、方便、效率高、无污染等优势在食品行业应用越来越广泛[4]。但在膜过滤使用过程中，膜污染仍然是一个很难避免的问题。膜污染又分为生物污染、有机物污染、无机物污染及物料原有物质(胶体污染)4种类型[5]。其中，有机物污染、无机物污染及物料原有物质(胶体污染)能通过一定的手段处理[6-7]，但生物污染不仅会加速膜不可逆污染，且微生物会附着在膜表面，随着膜设备的运行，微生物的胞外聚合物(EPS)[8]、微生物活/死菌体[9]、胶体物质等会形成生物膜，增加能耗，降低膜通量，缩短膜的使用寿命。因此，在膜过滤泡菜汁的过程中，微生物对膜的污染问题不容小觑，当堆积到一定厚度时，甚至会导致陶瓷膜报废。

膜过滤泡菜汁15 h内，通过测定膜通量、微生物的截留率、污染膜上微生物的分离鉴定、污染膜形貌的观察、EPS含量的变化、污染膜官能团分析等分析了膜生物污染的情况，为后续膜过滤泡菜汁中膜生物污染控制及清洗提供了理论基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验原料

泡菜汁：由广西某泡菜厂提供。取得的泡菜汁经8层灭菌纱布过滤之后即可作为膜处理的原料液。

1.2 实验设备

陶瓷膜中试设备。

1.3 实验方法

1.3.1 膜通量的测定

选用0.05 μm孔径陶瓷膜管过滤泡菜汁，在TMP=0.35 MPa， TEM=35 ℃， CFV=4～5 m/s的条件下， 测定膜过滤泡菜汁15 h内膜通量变化情况。膜通量的计算公式：

式中：J为膜渗透通量(L/(m2·h))；V为渗透液体积(L)；A为膜过滤面积；t为渗透液所需的时间(h)。

1.3.2 泡菜汁菌落总数的测定

测定不同时间(1，3，6，9，12，15 h)内，经陶瓷膜过滤后泡菜汁微生物菌落总数的变化情况。泡菜汁中细菌的菌落总数参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。泡菜汁中真菌的菌落总数参照GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》进行测定。

1.3.3 陶瓷膜管污染微生物的分离鉴定

1.3.3.1 细菌和真菌的分离纯化

测定不同时间(1，3，6，9，12，15 h)内，膜过滤后泡菜汁引起膜管污染微生物的分离鉴定。取3 mL经膜过滤泡菜汁及原泡菜汁样品于无菌平板中，用平板倾注法分别倒NA、PDA平板。待平板凝固后，NA平板倒置放在37 ℃生化培养箱中培养48 h，PDA平板倒置放在28 ℃生化培养箱中培养96 h，然后对平板内的细菌和真菌菌株进行分离纯化，分离纯化方法采用平板划线法，直到获得纯化的单菌落保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.3.2 DNA的提取及PCR扩增

将分离的细菌于LB液体培养基中培养15 h，参考细菌DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取，将分离的真菌于PDB液体培养基中培养72 h，参考真菌DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。PCR扩增采用50 μL反应体系：

细菌扩增引物：27F/1492R 27F：5′-AGAGTTTGA

TCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTG

TTACGACTT-3′。

真菌扩增引物：ITS1/ITS4 ITS1：5′-TCCGTAGGT

GAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3′。

PCR扩增程序见表1，PCR反应条件见表2。

表1 PCR扩增程序Table 1 PCR amplification procedure

表2 PCR反应条件Table 2 PCR reaction conditions

1.3.3.3 DNA与PCR扩增产物的保存方法

DNA与PCR产物分别放置在灭菌的1.5 mL的离心管和PCR管中密封，于-20 ℃保存备用。

1.3.3.4 DNA测序及序列相似性对比

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得清晰明亮的条带， PCR产物测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

16S rRNA和ITS序列分析：序列分析登录NCBI数据库，应用BLAST程序分别对所测得的16S rRNA和ITS序列与GenBank中的核酸进行相似性比对。利用MEGA 7.0软件[10]计算序列的碱基组成(compute nucleotide composition)[11]，计算遗传距离[12]，构建系统发育树[13]，检验各分支的置信度[14]。遗传距离基于Kimura 2-parameter模式计算，系统发育树基于Neighbor-Joining(NJ)法构建，各分支的置信度利用自展法(Bootstrap重复1000次)检验。

1.3.4 污染膜显微结构

将污染膜管脆断并获取其横断面和表面的样品，参考王贺[15]的方法，并稍作修改。

蓝宝石英文名称为Sapphire，源于拉丁文Spphins，意思是蓝色。象征着稳健、端庄和聪慧。自古以来，人们迷醉于蓝宝石内所蕴含的安静和强烈的力量。据说，蓝宝石是距离神灵最近的宝石，它湛蓝的颜色在任何时候都不会改变，甚至影响到蓝色天空的形成。

1.3.5 泡菜汁中胞外聚合物分布及组成测定

泡菜汁中胞外聚合物分布及组成的测定参考王贺的方法并稍作修改。蛋白含量以牛血清白蛋白(BSA)为标样，采用考马斯亮蓝法测定[16]。多糖含量以葡萄糖为标样，采用蒽酮硫酸法测定[17]。

1.3.6 污染的膜傅里叶转换红外光谱分析

将已被污染的陶瓷膜脆断并研磨成粉末，冷冻干燥后，再与烘干至恒重的溴化钾按一定的比例充分混合研磨均匀，真空压片后采用傅里叶转换红外光谱仪(FTIR)，扫描范围为400～4000 cm-1，扫描次数64次，对污染膜官能团进行分析。

1.4 实验数据分析

原始实验数据处理采用Excel及SPSS 26软件，每组实验重复3次，实验数据采用Origin 2019b软件进行绘制。

2 结果与讨论

2.1 膜过滤泡菜汁不同过滤时间的膜通量分析

膜设备本身和膜过滤泡菜汁工艺成本是影响陶瓷膜过滤泡菜汁工艺中的一项重要指标，膜过滤泡菜汁15 h内，膜通量随时间的变化结果见图1。

图1 膜过滤泡菜汁膜通量随时间的变化Fig.1 The changes of membrane flux of pickle juice by membrane filtration with time

由图1可知，随着膜过滤泡菜汁时间的延长，膜通量下降，且膜通量从开始过滤到过滤300 min的阶段下降速度较快，而在300～900 min之间膜通量的下降速度较300 min之前慢。究其原因可能是在过滤初期，泡菜汁含有分子粒径大小与平均孔径为0.05 μm的陶瓷膜相似的物质，在高跨膜压差的驱动下，进入到膜孔内进而阻塞膜孔或堆积到膜表面的“沟壑”处，且粒径大小与膜孔径相似的杂质含量越多，最终导致膜通量下降速度越快。膜污染到一定程度后，随着过滤时间的延长，膜通量下降较缓慢，原因可能是即使在较高的跨膜压差条件下，膜面的浓差极化程度也相差较小。

2.2 膜过滤泡菜汁不同过滤时间的微生物菌落总数变化

微生物的截留率也是评价陶瓷膜过滤泡菜汁效果的因素之一，0.05 μm陶瓷膜过滤泡菜汁除菌率随时间的变化结果见图2。

由图2可知，原泡菜汁中细菌、乳酸菌、真菌的菌落总数分别降低为55000，673500，3705 CFU/mL；膜处理起始阶段，泡菜汁中细菌、乳酸菌、真菌的菌落总数分别为75，240，6 CFU/mL，细菌、乳酸菌、真菌的去除率分别为99.96%、99.96%、99.99%, 3，6，9，12，15 h与1 h相比泡菜汁中细菌的截留率分别降低为0.0008%、0.01%、0.017%、0.03%、0.04%；泡菜汁中乳酸菌的截留率分别降低为0.010%、0.012%、0.018%、0.027%、0.04%；泡菜汁中真菌的截留率分别降低为0.005%、0.007%、0.011%、0.013%、0.0133%。由此可知，0.05 μm陶瓷膜过滤泡菜汁，随着过滤时间的延长，膜过滤除菌率降低，随着膜污染程度的加深，陶瓷膜过滤泡菜汁的除菌效果也随之降低。

2.3 泡菜汁过滤中膜污染微生物的分离鉴定

从污染的陶瓷膜中分别分离出细菌和真菌16株和5株，最终选取9株细菌及4株真菌的DNA为模板，细菌以27F和1492R为引物进行16S rRNA扩增，真菌以ITS1和ITS4为引物进行ITS扩增，并将得到的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，见图3。

图3 PCR扩增紫外凝聚成像图Fig.3 UV agglutination images amplified by PCR

由图3 可知，9株细菌及4株真菌的扩增产物都是条带明亮清晰且单一不拖尾，无非特异扩增现象，且细菌菌株的16S rRNA序列片段大小均在1200～1400 bp左右，真菌菌株的ITS序列片段大小均在500～700 bp左右，满足测序要求。

2.3.2 系统发育分析

将9株细菌和4株真菌采用GenBank序列数据库在NCBI上根据BLAST检索搜索与上述所测得序列相似度较高的16S rRNA和ITS序列，分析比较后删除相同的序列，最终筛选最相似的16S rRNA和ITS序列与供试菌株的序列采用NJ法进行系统发育树的构建。

细菌结果见图4。

图4 基于16S rRNA序列的9株细菌的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 9 strains of bacteria based on 16S rRNA sequence

由图4可知，细菌的NJ系统进化树各主分支的自举支持率范围在67%～100%，且各主分支的后验概率大部分在0.90～1.0之间。最终将9株供试菌株归为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、放线菌(Actinobacteriabacterium)、马赛短芽孢杆菌(Brevibacillusmassiliensis)、丝状芽孢杆菌(Bacillusfilamentosus)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、发酵黏液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)及乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis)。

真菌结果见图5。

图5 基于ITS序列的4株真菌的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of 4 strains of fungi based on ITS sequence

由图5可知，真菌的NJ系统进化树各主分支的自举支持率在100%，且各主分支的后验概率大部分在0.95～1.0之间。最终将4株供试菌株归为卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)和库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。

2.4 膜过滤泡菜汁不同过滤时间的污染膜SEM分析

泡菜汁膜过滤不同时间(新膜、3，6，9，12，15 h)，取不同过滤时间下获得的膜管进行SEM分析，结果见图6和图7。被污染的膜表面无明显的结垢，但膜内表面呈浅浅的黄色，与膜过滤后的泡菜汁颜色相似，推测可能是泡菜汁中的色素部分被截留到膜表面。采用SEM观察泡菜汁膜过滤不同时间内膜被污染的情况。

新的陶瓷膜及不同过滤时间陶瓷膜横断面的SEM图见图6中A～F。由图6中A可知，新的陶瓷膜的横断面中会有部分微小颗粒，可能是在脆断过程中膜管本身材料抖落所致。0.05 μm的陶瓷膜内为非均匀结构，且最大孔径为0.42 μm，因此泡菜汁中的小分子物质以及部分粒径小于0.42 μm的物质能够透过陶瓷膜；范围在0.05～0.42 μm的小分子物质被截留或吸附在膜孔内，堵塞膜孔造成膜污染；而被截留的物质粒径大于0.42 μm。由图6中B～F可知，随着过滤的进行，新膜和污染膜表面有明显的区别，泡菜汁中的小分子物质或悬浮物明显吸附或沉积在膜表面以及膜孔内，致使膜横断面孔径堵塞越来越严重，且时间越长，横断膜面堆积的杂质越多。

新的陶瓷膜及不同过滤时间陶瓷膜内膜表面的SEM图见图7中A～F。由图7中A可知，新的陶瓷膜内膜表面由非均匀、随机分布的微粒任意堆积而成，陶瓷膜的孔径就是由于微粒与微粒之间的非紧密结合形成的。由图7中B可知，陶瓷膜过滤泡菜汁运行3 h后的污染膜孔径表面覆盖着少量的污染物，且在膜孔隙中有疑似椭圆形及杆状的微生物。运行6，9，12，15 h后的污染膜管上也均有此现象出现，且陶瓷膜过滤泡菜汁运行时间越长，膜表面的污染物质就越多，膜面污染越严重。运行15 h后的陶瓷膜结果见图7中F，虽然膜表面覆盖着许多的污染物，但仍然能发现膜孔的存在，说明陶瓷膜过滤泡菜汁运行15 h后的膜污染还未形成滤饼层污染，主要的污染形式仍为膜孔内污染。

2.5 泡菜汁过滤中膜污染官能团分析

采用FTIR光谱仪分析泡菜汁陶瓷膜过滤中被污染陶瓷膜的官能团，结果见图8。

图8 不同运行时间后陶瓷膜傅里叶红外光谱Fig.8 FTIR spectra of ceramic membrane after different operation time

结果显示：FTIR光谱仪分析表明陶瓷膜过滤泡菜汁中，引起膜污染的主要物质有蛋白质、多糖、泡菜汁中的酚类物质以及少量脂类化合物。

2.6 膜过滤时间对泡菜汁中胞外聚合物含量的影响

泡菜汁膜过滤不同时间(1，3，6，9，12，15 h)，泡菜汁中EPS含量分析结果见图9。

图9 泡菜汁中蛋白含量随时间的变化Fig.9 The changes of protein content in pickle juice with time

由图9可知，原泡菜汁中EPS含量为13.73 mg/mL，经膜处理后，泡菜汁中EPS含量显著下降。膜过滤3，6，9，12，15 h后泡菜中EPS分别增加了1.28%、9.09%、10.28%、19.56%、25.15%，其中SEPS含量分别增加了7.80%、18.44%、24.67%、84.47%、97.79%；TB-EPS含量分别增加了16.95%、20.39%、25.14%、30.06%、55.17%；LB-EPS含量分别增加了10.14%、18.12%、27.42%、36.48%、44.75%。由此可知，随着膜过滤的进行，结合态EPS含量大于SEPS含量，且泡菜汁中疏水性大分子芳香族蛋白质主要在TB-EPS中，LB-EPS中主要是小分子的有机酸[25]。随着过滤的进行，泡菜汁中EPS含量增加，由于EPS的双层结构将微生物包裹起来，能够在极端的条件下对泡菜汁中的微生物起到良好的保护作用；泡菜汁中的蛋白质和多糖类物质被截留，不仅为微生物的生长代谢提供了营养物质，而且EPS的组成及成分比例差异被附着在微生物及其微生物絮凝物表面，因此会对微生物及其微生物絮凝物表面的亲水性和疏水性等特性产生不同程度的影响[26-27]，这些均能促使膜通量降低，膜污染越来越严重。

3 结论

0.05 μm孔径膜在最适条件下过滤泡菜汁，膜运行至15 h时，膜通量降低43.49%；微生物截留率降低0.4%；从污染膜管上检出的微生物细菌主要是芽孢杆菌、放线菌和乳杆菌；真菌为卡尼克酵母菌和库德里阿兹威毕赤酵母菌。膜孔内和膜内表面污染，膜运行时间越长，膜管污染越严重。引起膜污染的物质主要是蛋白质、多糖、泡菜汁中的酚类物质以及少量脂类化合物。运行15 h时，EPS含量增加25.15%。膜过滤泡菜汁连续运行15 h，若不及时清洗，不仅过滤效果低，甚至会造成膜管报废，增加生产成本。因此，膜过滤泡菜汁的最适周期为15 h。