饲粮中添加丙酮酸肌酸对锦江牛体外发酵特性的影响

2022-08-04张陶泽李艳娇卢顾伟瞿明仁赵向辉邱清华欧阳克蕙

饲料工业 2022年14期

■毛康张陶泽李艳娇卢顾伟瞿明仁赵向辉邱清华欧阳克蕙

（江西省动物营养重点实验室/动物营养与饲料安全创新团队，江西农业大学，江西南昌 330045）

瘤胃是反刍动物区别其他单胃动物最显著的特征，瘤胃发酵功能的好坏直接影响反刍动物的健康和生产性能。因此如何正确科学地调控瘤胃发酵功能，一直是反刍动物营养研究的关键。丙酮酸肌酸（creatine pyruvate，CrPyr）是一种新型的功能营养素，具有肌酸的特性和丙酮酸的功能，其中肌酸的含量占60%，丙酮酸的含量占40%[1]。肌酸是能量代谢和蛋白质代谢过程中重要的含氮化合物之一。在过去几十年里，肌酸被广泛运用于反刍动物营养当中，作为氮的补充剂。有研究表明，瘤胃细菌产生的肌酸酶将肌酸降解为尿素和肌氨酸，然后在尿素酶的作用下将尿素催化为CO2和NH3[2]。丙酮酸是能量转化过程中重要的代谢产物[3]。对于反刍动物而言，丙酮酸还是瘤胃微生物在对碳水化合物进行发酵后的一个重要中间产物[4]，瘤胃内丙酮酸在转化为挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）的过程中所释放的ATP 又可以促进微生物的生长。在前期的研究中，山羊日粮中添加丙酮酸钙可以提高瘤胃VFA的含量，降低日粮中蛋白质的降解，并降低瘤胃氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）浓度[5]。CrPyr 可以给机体提供丙酮酸和肌酸两种代谢产物[6]，可以推测CrPyr能够同时促进瘤胃能量代谢和氮的供应，促进瘤胃发酵功能。目前关于饲粮中添加CrPyr对肉牛体外瘤胃发酵的影响在国内外还未见报道，因此，本试验旨在通过体外人工瘤胃发酵方法，探讨CrPyr对体外瘤胃发酵参数的影响，为CrPyr在反刍动物生产上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 CrPyr

CrPyr 购买于上海津力药业股份有限公司，其中肌酸含量≥58.0%，丙酮酸含量≥30.0%。

1.1.2 发酵底物

发酵底物由粗料稻草，精料玉米、豆粕、麦麸等组成，将饲料原料充分粉碎后，按照精粗比2∶8进行混匀配制，发酵底物混匀之后放在65 ℃烘箱当中烘干备用。

1.1.3 缓冲液的配制

按顺序添加520.2 mL 纯化水+208.1 mL 缓冲液（B）+208.1 mL常量元素溶液（C）+ 0.1 mL微量元素溶液（A）+1.0 mL 刃天青溶液（D）+62.4 mL 还原液（E），通入CO2，直至溶液由淡蓝色转变为无色。调整成人工唾液的A、B、C、D、E配方见表1。

表1 人工唾液的组成成分

1.1.4 瘤胃液供体动物及其饲养管理

选取3 头健康状况良好的锦江公牛，体重300～350 kg，每天饲喂两次（6:00 和18:00），自由饮水。基础饲粮组成及营养水平见表2。

表2 基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.1.5 瘤胃液的采集

于下午采食前，首先用牛鼻钳固定牛头，接着使用胃管式瘤胃液采集器采集瘤胃液，去除最初的50 mL瘤胃液（避免唾液的影响），然后将收集到的瘤胃液迅速装入充满CO2且经过灭菌处理的保温瓶中，收集完毕，盖上保温瓶盖，带回实验室。将4 层纱布过滤后的瘤胃液通入CO2气体5 min，并向预先充满CO2且加好发酵底物的培养瓶内分别加入20 mL 瘤胃液和40 mL 人工唾液。连接好培养瓶和注射器后打开通气阀和振荡开关，培养开始。

1.2 试验设计

试验采取单因素设计，共设6 个组（分别添加0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、3.2%的CrPyr），设3个测定时间点分别为0、12 h和24 h，每个时间点有4个重复。

1.3 指标的测定

发酵0、12、24 h，将对应的发酵瓶放置冰盒中30 min，终止发酵。随后测定发酵液的pH，接着发酵液用尼龙网布进行过滤，过滤好的瘤胃液分装到10 mL离心管，然后放入-20 ℃的冰箱中保存，用于测定瘤胃发酵参数：NH3-N、微生物粗蛋白（microbial crude protein, MCP）、VFA以及丙酮酸和肌酸的含量。尼龙网布中的残渣进行回收，65 ℃的烘箱中烘干，用于测定干物质的消化率。

1.3.1 pH的测定

发酵液的pH 采用上海雷磁PHS-3C 型pH 计进行测定，在测定之前使用pH 4.01和pH 6.80的标准缓冲液进行校正。

1.3.2 NH3-N的测定

参考冯宗慈等[7]利用比色法测定发酵液中NH3-N的含量。

1.3.3 MCP的测定

MCP 采用考马斯亮蓝法[8]，使用752 紫外可见分光光度计来测定。

1.3.4 VFA的测定采用GC-1690气相色谱仪（杭州科晓化工仪器设备有限公司）FID 检验器测定VFA，色谱柱：Nukol 毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；进样口温度220 ℃；检测器温度250 ℃；柱温升温程序：起始温度60 ℃，然后以20 ℃/min的升温速率升至190 ℃，保持3 min；进样口压力：100 kPa；SPL分流比：20∶1；气体流速：载气氮气（N2）75 mL/min，氢气（H2）70 mL/min，空气50 mL/min；进样量：1 μL。

1.3.5 干物质消化率

式中：M1——发酵前底物重（g）；

M2——发酵后残渣重（g）。

1.3.6 丙酮酸的测定

丙酮酸使用丙酮酸试剂盒进行测定，试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。

式中：M3——发酵前丙酮酸的含量（μmol/mL）；

M4——发酵后丙酮酸的含量（μmol/mL）。

1.3.7 肌酸的测定

肌酸使用比色法进行测定[9]。肌酸可在碱性条件下与联乙酰-α萘酚发生反应，生成红色产物，在520 nm形成吸收峰。

式中：M5——发酵前肌酸的含量（mg/L）；

M6——发酵后肌酸的含量（mg/L）。

1.4 数据统计与分析

试验数据用Excel 2016软件进行初步整理，统计结果使用SPSS 17.0进行单因素方差分析，用Duncan’s法进行多重比较，使用GraphPad Prism 6.01绘图。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。。

2 结果与分析

2.1 CrPyr 对瘤胃体外发酵pH、NH3-N、MCP、干物质表观消化率的影响（见表3、图1）

由表3 可知，发酵0 h 和12 h，添加不同剂量的CrPyr 对瘤胃液pH 无显著影响，但发酵24 h，添加组的pH呈现二次下降后上升的趋势，1.6%组的pH显著低于对照组（P＜0.05），但处在正常水平。发酵0 h，添加CrPyr对NH3-N无显著影响；发酵12 h，1.6%组和3.2%组的NH3-N浓度显著高于对照组（P＜0.05）；发酵24 h，3.2%组的NH3-N浓度极显著高于其余各组（P＜0.01）。发酵0 h，不同CrPyr 添加量对MCP 的浓度无显著影响；发酵12 h，1.6%组显著降低了MCP 的含量（P＜0.05），但发酵24 h 之后添加组MCP 的含量均显著高于对照组（P＜0.05）。在发酵过程中添加CrPyr对干物质表观消化率无显著影响。由图1可知，随着发酵时间的延长，各添加组NH3-N的浓度呈现先显著性地下降后显著性地升高的变化趋势（P＜0.05）；与0 h相比，发酵12 h，1.2%组的MCP 浓度显著性增加（P＜0.05），其余各添加量组的MCP 浓度无显著性变化，但发酵24 h后，各组MCP的浓度显著性升高（P＜0.05）。

图1 添加不同剂量的CrPyr在不同时间点对NH3-N和MCP的影响

表3 CrPyr对肉牛体外瘤胃发酵参数和干物质表观消化率的影响

2.2 CrPyr对发酵液中VFA含量的影响（见表4、图2）

由表4可知，发酵0 h，添加组的总挥发性脂肪酸（Total VFA，TVFA）与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）；发酵12 h，0.4%组的TVFA、乙酸和异戊酸的浓度极显著高于对照组（P＜0.01）；但与1.6%组相比，0.4%组的丙酸和异丁酸的浓度显著升高（P＜0.05）、丁酸的浓度极显著升高（P＜0.01）。发酵24 h，1.6%组的TVFA、乙酸和异戊酸浓度极显著高于对照组（P＜0.01），异丁酸浓度显著高于其余各组（P＜0.05）；发酵0 h和24 h，3.2%组的乙酸/丙酸值极显著高于其余各组（P＜0.01）。由图2可知，与发酵0 h相比，各组中乙酸、丙酸和TVFA的浓度在发酵12 h均显著性增加（P＜0.05），但发酵24 h之后，1.6%组的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和TVFA的浓度以及3.2%组的戊酸和异戊酸的浓度均显著高于发酵12 h（P＜0.05）。而乙酸/丙酸值在发酵12 h时与对照组相比显著下降（P＜0.05），但其比值在发酵24 h之后与12 h相比无显著性变化（P＞0.05）。

图2 添加不同剂量的CrPyr在不同时间点对VFA的影响

表4 CrPyr对发酵液中VFA含量的影响

2.3 CrPyr 对发酵液中丙酮酸和肌酸含量的影响（见表5、图3）

由表5可知，发酵0 h，1.2%、1.6%、3.2%组发酵液中丙酮酸浓度极显著高于对照组（P＜0.01）；发酵12 h，各组之间的丙酮酸浓度无显著性差异（P＞0.05），但发酵24 h后，与其余各组相比，1.2%组的丙酮酸浓度最低，3.2%组丙酮酸浓度极显著高于其余各组（P＜0.01）。发酵0、12 h和24 h，1.2%、1.6%和3.2%组中肌酸浓度均极显著高于对照组（P＜0.01），且随着添加量的增加肌酸浓度呈现增加的趋势。由图3可知，与发酵0 h 相比，发酵12 h 之后，0.8%、1.2%、1.6%和3.2%添加组的丙酮酸浓度显著性下降（P＜0.05），但对照组和0.4%添加组丙酮酸的含量无显著性变化，并且发酵24 h之后各组丙酮酸的浓度与发酵12 h相比，均无显著性差异；与发酵0 h相比，各组肌酸的浓度在发酵12 h 后均无显著性差异，但在发酵24 h 之后，1.2%、1.6%和3.2%添加组肌酸的浓度显著低于发酵12 h的浓度（P＜0.05）。

图3 添加不同剂量的CrPyr在不同时间点对丙酮酸和肌酸含量的影响

表5 CrPyr对发酵液中丙酮酸和肌酸含量的影响

3 讨论

3.1 CrPyr对体外培养发酵液pH、干物质表观消化率的影响

瘤胃液pH 反映瘤胃的代谢状态，是食糜中VFA与唾液缓冲液相互作用、瘤胃上皮对VFA吸收及食糜流出等综合作用的结果[10]。因本试验是体外发酵，只有微生物对底物的发酵产生VFA的积累，从而造成对pH 的影响。pH 过高和过低都会影响瘤胃微生物的发酵。研究表明瘤胃内正常pH的范围是6～7[11]，本试验中各组的pH 均处在这个范围之内，表明人工瘤胃在试验中处于正常的发酵状态，并且在发酵24 h 后，添加组pH 低于对照组，其原因可能是添加不同水平的CrPyr 提高了瘤胃内VFA 的含量，从而降低了瘤胃pH。干物质降解率反映了饲料原料被消化利用的难易程度，也可以体现饲用价值的高低以及被微生物和机体组织所利用的程度[12-13]，本试验可以发现在发酵12 h和24 h，随着CrPyr添加量的提高，干物质表观消化率在数值上呈现先上升后下降的趋势，表明低浓度CrPyr添加量在一定程度上能够促进干物质消化，但浓度过高抑制干物质消化。其原因可能是CrPyr在瘤胃当中分解为丙酮酸和肌酸，丙酮酸是能量转化过程中重要的代谢产物[3]，在瘤胃中直接作为VFA合成的前体物质，CrPyr添加量过高可能降低了瘤胃微生物对碳水化合物的依赖。

3.2 CrPyr对体外培养发酵液丙酮酸、肌酸、NH3-N和MCP的影响

丙酮酸和肌酸都是能量代谢和蛋白质代谢的重要中间产物。丙酮酸在转化成VFA 的时候释放ATP可以促进瘤胃微生物的生长，肌酸在瘤胃中的适应性取决于氨的缓慢释放，可以为MCP 合成提供直接原料。有研究表明，CrPyr 可以给机体提供丙酮酸和肌酸两种代谢产物[14]。本试验中，发酵0 h和24 h，3.2%组的丙酮酸含量极显著高于其余各组，并且随着发酵时间的延长，瘤胃液中丙酮酸的含量呈现一个先显著性下降后保持平稳的趋势，表明发酵液中丙酮酸的降解是一个动态过程，因为添加CrPyr，导致发酵液中丙酮酸的含量增加，使瘤胃微生物可以充分利用丙酮酸，所以此时丙酮酸的消耗速率大于生成速率，并且丙酮酸的消耗速率与CrPyr 的添加量呈线性关系。12 h 之后，随着添加的丙酮酸含量降低，瘤胃中生成丙酮酸的速率与消耗速率趋于平衡。发酵0、12、24 h，1.2%、1.6%和3.2%组的肌酸含量极显著高于对照组，随着发酵时间的延长，肌酸含量呈现一个先保持平稳后显著性下降的变化过程，并且肌酸的消耗量与CrPyr的添加量呈现负相关的关系。分析其原因可能是刚开始丙酮酸的大量存在减缓了肌酸的消耗。

NH3-N是瘤胃内肽、氨基酸、蛋白质、尿素和其他非蛋白氮共同分解的最终产物，也是瘤胃微生物合成MCP 的主要原料。瘤胃内的最佳NH3-N 的含量在0.35～29.00 mg/dL[15]。有研究表明肌酸在瘤胃的降解分为两步，第一步是瘤胃细菌产生肌酸酶使肌酸降解为尿素和肌氨酸，第二步是在尿素酶的作用下催化生成CO2和NH3[2]。本试验NH3-N 的含量均处在正常的范围。发酵12 h 和24 h，随着添加量的增加，其含量均高于对照组，其原因可能是肌酸的降解导致。由肌酸含量的变化可以看出，在发酵24 h后肌酸的含量显著性低于0 h，说明肌酸在这个时间段被降解生成氨，从而增加了处理组NH3-N在发酵24 h的浓度。

MCP是反刍动物最主要的蛋白质来源，其含量的高低取决于瘤胃中碳源和氮源的比例是否适宜。本试验发酵24 h添加组的NH3-N和MCP的含量均高于对照组，且MCP含量变化和NH3-N的变化趋势是一致的，均呈现一个先升高后下降的趋势，但3.2%组NH3-N的浓度极显著地增高，而其对应的MCP 的含量又下降，说明过高的CrPyr会降低MCP的合成，适宜的CrPyr可以有效促进NH3-N向MCP转化，这与陈秀霞等[16]的研究结果相似。其原因可能是CrPyr进入瘤胃之后分解为丙酮酸和肌酸两种单体，肌酸降解提供MCP合成的原料，丙酮酸间接提供MCP 合成所需的能量，从而促进瘤胃微生物的活动，提高了MCP的合成量。

3.3 CrPyr对体外培养发酵液VFA的影响

VFA 的含量和组成比例是评价瘤胃发酵方式和发酵能力的直接指标，并且是反刍动物能量利用的主要形式[17]。而VFA 主要由乙酸、丙酸和丁酸组成，占TVFA 的95%，乙酸有利于动物的体脂率和乳脂率提高，丙酸有利于葡萄糖转化和储存，丁酸可为机体各组织供能[18]。本试验中，在发酵24 h，1.6%添加组的TVFA极显著高于其余各组，而乙酸/丙酸值极显著低于3.2%添加组，却与其余组相比无显著性差异，表明该添加剂量下可以促进VFA的生成，并且优化VFA的组成，提高能量的利用效率，为MCP的合成提供了碳源，并且分析本试验中随着发酵时间的延长pH降低的现象，可能与发酵液中VFA含量升高有关。有研究表明，添加能量代谢中间产物苹果酸可以提高瘤胃体外发酵VFA的浓度，改善瘤胃发酵能力[19]，与本试验结果相似。然而张荃[10]在山羊饲粮中添加丙酮酸钙，可以造成瘤胃液中乙酸的比例下降、丙酸和丁酸的比例上升，与本试验的结果有差异。分析其原因可能是添加量的不同造成的。