大黄素对免疫应激仔猪器官指数、血清生化指标以及血清抗氧化能力的影响

■杨 文 马中华 侯晓晓 施力光 姬孟瑶 荀文娟*

(1.海南大学动物科技学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737)

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，可诱导氧化应激和急性炎症，导致各种病理生理损伤。LPS可以刺激免疫细胞产生过量的自由基，从而导致氧化应激，LPS还会降低动物机体抗氧化酶活性[1]，加剧氧化应激的影响。张海文等[2]研究发现，在屯昌仔猪腹腔注射LPS会显著降低肝脏中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活性。LPS 可以通过NF-κB通路，上调白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎细胞因子的表达[3]。促炎细胞因子水平显著升高是机体发生炎症的重要特征，过表达的促炎细胞因子会导致机体受到严重的免疫应激，损伤机体内的组织器官。

大黄素（Emodin，ED）是大黄、虎杖、何首乌等中药的有效单体成分，化学名1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌，分子式C15H10O5，在临床治疗和生产实践上被广泛应用[4]。据报道，大黄素具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗肿瘤等多种生物学活性[5-7]。大黄素可以通过抑制NF-κB炎症通路发挥抗炎作用[8]，此外，大黄素还具有显著的抗氧化功效。研究表明大黄素能通过其抗氧化和抗炎活性缓解重症急性胰腺炎[9]。马春艳等[10]研究发现，大黄素或大黄素联合芹菜素可降低自发性高血压大鼠肾脏丙二醛（MDA）和血管紧张素Ⅱ含量，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性以减轻肾脏过氧化情况。然而，大黄素是否能缓解LPS诱导的断奶仔猪免疫应激，还未见相关报道。

本试验通过腹腔注射LPS 建立断奶仔猪免疫应激损伤模型，通过在日粮中添加300 mg/kg 大黄素研究大黄素对免疫应激仔猪器官指数、血清生化指标以及血清抗氧化能力的影响，旨在为畜禽养殖中应对脂多糖诱导的断奶仔猪免疫应激损伤以及大黄素作为饲料添加剂的推广应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大黄素购于南京景竹生物科技有限公司，纯度为98%；LPS溶液购于Sigma公司；血清生化指标测定中相关试剂购于北京丹大生物技术有限公司和南京建成生物工程研究所有限公司；酶联免疫试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司；抗氧化试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 试验设计

试验选取24头胎次相近、健康状况良好的28日龄三元杂交（杜×长×大）断奶仔猪，随机分为4 个组，每组6个重复，公母各半，每只仔猪均进行单笼饲养。对照组（CON）：饲喂基础日粮，宰前腹腔注射无菌生理盐水；大黄素处理组（ED）：饲喂基础日粮+300 mg/kg ED，宰前腹腔注射无菌生理盐水；LPS应激组（LPS）：饲喂基础日粮，宰前腹腔注射100 μg/kg LPS；大黄素+LPS处理组（ED-LPS）：饲喂基础日粮+300 mg/kg ED，宰前腹腔注射100 μg/kg LPS。试验期21 d[11-12]，在第21天屠宰。试验饲粮参照NRC（2012）营养需要配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及其营养水平(风干基础)

1.3 饲养管理

本试验在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所畜牧研究基地进行。试验期间，试验动物自由采食及饮水，每天饲喂两次，分别为7：00及17：00，所有仔猪饲养在环境卫生良好的猪舍中，每天清扫和消毒猪舍，猪舍温度控制在25～28 ℃。

1.4 样品采集

试验第21天屠宰全部仔猪，屠宰前空腹12 h。在注射LPS或生理盐水4 h后，前腔静脉采集血液样本，室温静置至自然凝固后，用离心机以3 000 r/min离心5 min制备血清样本，-80 ℃保存用于分析血清抗氧化指标及炎性细胞因子含量。注射LPS或生理盐水6 h后屠宰所有仔猪，并迅速收集内脏，计算器官指数。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 器官指数

器官指数（g/kg）=脏器重（g）/活体重（kg）

1.5.2 血清生化指标测定

血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酐（CRE）含量和碱性磷酸酶（ALP）的含量使用普朗PUZS-600b全自动生化仪测定，相关试剂购于北京丹大生物技术有限公司。血清中谷草转氨酶（AST）的活性采用南京建成生物工程研究所有限公司研制的试剂盒测定，测定严格按照说明书操作完成。

1.5.3 血清抗氧化能力测定

血清的总抗氧化能力（T-AOC）、MDA 和微量还原型谷胱甘肽（GSH）含量以及GSH-Px、SOD、CAT 的活性采用南京建成生物工程研究所有限公司研制的试剂盒测定，测定严格按照说明书操作完成。

1.5.4 血清炎性因子的含量测定

血清中炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量测定采用酶联免疫试剂盒，采购于上海酶联生物科技有限公司，测定严格按照说明书操作完成。

1.6 数据处理

数据经Excel 2019 软件整理后采用SPSS 21.0 进行分析，结果用“平均值±标准误”表示。所有数据利用单因素方差分析（ANOVA）中的Duncan’s 法进行组间多重比较，以P＜0.05 为组间差异显著性的判断标准。

2 结果与分析

2.1 大黄素对免疫应激断奶仔猪免疫器官指数的影响（见表2）

表2 大黄素对免疫应激断奶仔猪免疫器官指数的影响（g/kg）

由表2 可知，各处理组中断奶仔猪的心脏、脾脏以及肾脏器官指数均无显著性差异（P＞0.05）。与CON 组相比，ED-LPS 组肝脏和肺脏器官指数显著降低（P＜0.05）。与LPS 组相比，ED-LPS 组肝脏器官指数显著降低（P＜0.05）。

2.2 大黄素对免疫应激断奶仔猪血清生化指标的影响（见表3）

表3 大黄素对免疫应激断奶仔猪血清生化指标的影响

由表3 可知，各处理组仔猪血清中TP、ALB 含量以及ALT、AST 活性无显著性差异（P＞0.05）。与CON组相比，LPS组血清中CRE含量以及ALP活性显著提高（P＜0.05）。与LPS 组相比，ED-LPS 组血清中ALP活性显著降低（P＜0.05）。

2.3 大黄素对免疫应激断奶仔猪血清抗氧化指标的影响（见表4）

由表4 可知，各组仔猪血清中MDA 含量和SOD活性无显著性差异（P＞0.05）。与CON组相比，LPS组血清CAT、GSH-Px 活性和GSH 含量显著降低（P＜0.05），ED 组血清T-AOC 含量显著提高（P＜0.05），ED-LPS 组血清CAT、GSH-Px 活性显著降低（P＜0.05），T-AOC 含量显著升高（P＜0.05）。与LPS 组相比，ED-LPS 组血清CAT 活性、GSH 含量和T-AOC 含量显著提高（P＜0.05）。

表4 大黄素对免疫应激断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

2.4 大黄素对免疫应激断奶仔猪血清炎性细胞因子含量的影响（见表5）

由表5 可知，各组中血清IL-1β含量无显著性差异（P＞0.05）。与CON组相比，LPS组血清IL-6含量显著提高（P＜0.05），而ED-LPS 组与CON 组无显著差异（P＞0.05）。与ED 组相比，LPS 组血清TNF-α含量显著提高（P＜0.05）。

表5 大黄素对免疫应激断奶仔猪血清炎性细胞因子含量的影响(pg/mL)

3 讨论

LPS是细胞因子的强诱导剂，可以诱导机体产生多种细胞因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α等炎性因子，使机体发生严重的炎症反应[13]。本试验通过宰前6 h腹腔注射LPS建立断奶仔猪应激模型，探究大黄素对免疫应激仔猪器官指数、血清生化指标以及血清抗氧化能力的影响。

器官指数是判断动物体器官发育状况的一种重要的指标，其大小能够在一定程度上反映该器官的发育情况和健康状况[14]。多数中草药成分本身并没有毒性，但是进入机体后在代谢过程中可能会转化为毒性化合物而导致机体损伤。有研究发现，大黄素能通过抑制线粒体呼吸链复合物的功能影响氧化磷酸化途径，最终导致线粒体损伤和体外肝细胞凋亡[15]。大黄素对尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）具有一定的抑制作用，可导致胆汁代谢紊乱，引起胆汁淤积性肝损伤[16]。本试验中，大黄素的添加会使仔猪肝脏和肺脏的器官指数呈降低趋势，但无显著差异，说明300 mg/kg大黄素可能会在一定程度上影响仔猪肝脏和肺脏的正常发育。

血清生化指标能够反映机体的生理状态和健康状况。血清生化的各项指标中，TP 和ALB 含量的高低能直接反映机体蛋白质合成代谢状况[17-18]。ALT和AST 被认为是肝功能的敏感标志物[19]，当肝脏受到损伤时，ALT和AST会被释放到血液循环中。CRE是反映肾功能的重要指标，CRE 含量升高时，意味着肾功能的损伤[20]，ALP 活性的高低可反映动物对蛋白质和脂类的代谢效率[21]，同时其是胆汁淤积性肝病中最先升高的酶[22]。Wang等[23]研究发现，断奶仔猪腹腔注射LPS会显著提高血清AST和ALP活性。魏啸等[24]研究发现，小鼠腹腔注射LPS 会显著升高血清中CRE 水平。本试验中，LPS导致仔猪血清中ALP和CRE含量显著提高，与上述报道一致，表明LPS 可能会诱导肝脏和肾脏功能损伤。有研究表明，大黄素能通过抑制Toll 样受体4（TLR4）信号通路下游蛋白的表达减轻LPS 诱导的急性肝损伤[25]。王少杰等[26]研究发现，大黄素能降低脂肪肝小鼠血清中三酰甘油（TG）、AST、ALT 水平，具有肝保护作用。本试验中，日粮中添加大黄素能缓解LPS 导致的仔猪血清ALP 和CRE 含量异常升高，说明300 mg/kg 大黄素可能对LPS 诱导的肝脏和肾脏功能损伤有一定的保护作用。

正常情况下，机体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，当自由基的产生超出了机体的清除能力时，就会打破平衡而导致氧化应激[27]。血清中MDA、SOD、GSH、GSH-Px、CAT 和T-AOC 是反映机体氧化应激程度以及抗氧化能力的指标。GSH 是机体内最重要的非酶性抗氧化物，能够清除自由基，GSH 的含量是衡量机体抗氧化能力的重要因素[28]。GSH-Px能够以GSH 为底物，特异催化GSH 对过氧化氢的还原反应[29]。CAT能够与SOD协作，降低过氧化氢对机体的损伤[30]。本试验中，LPS显著降低仔猪血清中CAT、GSH-Px 活性和GSH 含量，表示LPS 诱导机体产生了严重的氧化应激。潘广涛等[31]发现，大黄素可以通过调节肝脏氧化应激对急性肝损伤起保护作用。张昊悦等[32]试验发现，大黄素能调节Nrf-2/HO-1和MAPK信号通路，抑制LPS诱导的细胞炎症和氧化应激。本试验中，日粮中添加大黄素能缓解LPS导致的仔猪血清抗氧化酶活性降低，同时提升T-AOC，与以上报道一致，说明300 mg/kg 大黄素可以提高仔猪抗氧化能力，缓解断奶仔猪的氧化应激。

IL-1β、IL-6、白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素17（IL-17）和TNF-α等促炎细胞因子水平显著升高是机体炎症的重要特征[33]。LPS 由TLR4 识别，能激活NF-κB和MAPK信号通路，导致机体内的炎症介质如一氧化氮（NO）产生，最终导致机体发生炎症。康保聚等[34]研究发现，断奶仔猪腹腔注射LPS后血清IL-6和TNF-α水平升高。本试验在LPS组仔猪血清中观察到较高的IL-6和TNF-α水平，意味着仔猪体内有炎症发生。研究发现，大黄素能调节Nrf-2/HO-1和MAPK信号通路，抑制LPS诱导的细胞炎症[32]。此外，大黄素能通过PPARγ依赖途径抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症[35]。本试验中，日粮中添加300 mg/kg大黄素能缓解LPS导致的仔猪血清IL-6和TNF-α水平升高，说明大黄素具有抗炎作用，能缓解LPS诱导的仔猪炎症。

4 结论

日粮中添加300 mg/kg大黄素可以提高仔猪机体抗氧化能力，缓解LPS诱导的断奶仔猪氧化应激和炎症。