微生物试管法测定叶酸含量的方法研究

胡淑红

绿城农科检测技术有限公司，浙江杭州 310000

0 引言

叶酸，是一种水溶性B族维生素，俗称维生素B9，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必须的物质，在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作用，尤其对红细胞的形成具有促进作用，缺乏时可导致红细胞中血红蛋白生成减少、细胞成熟受阻，导致巨幼红细胞性贫血，因此对孕妇和婴幼儿尤为重要。

我国食品安全国家标准对婴幼儿配方乳粉（简称“婴配粉”）中强化维生素的含量有严格要求，对于婴幼儿叶酸含量一般要求在2.5~12.0 μg/100 kJ之间，较大婴儿和幼儿最低含量为1 μg/100 kJ[1，2]。叶酸能够促进婴幼儿身体器官的发育，增加婴儿的免疫力，因此育龄期女性合理补充叶酸，是促进优生优育的重要措施[3]。研究表明，叶酸摄入不足或代谢通路受阻会增加脑卒中的风险[4]，低水平的叶酸也可能是阿尔兹海默症的危险因素[5]，因此维持较好地叶酸水平对降低高血压、预防和控制心脑血管疾病具有重要意义[6]。

微生物法可以测定成分复杂样品中的叶酸含量，具有批量测定成本较低的优点，结果较液相法更准确，灵敏度更高，但操作复杂，试验周期长。

本文优化了《GB 5009.211-2014食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》方法，改进微生物法检测叶酸操作繁琐和试验周期长的缺点，以婴配粉为样本，优化接种液的制备方法和叶酸培养液的培养时间，并对该方法的精密度和准确度进行了研究。

1 试验方法

1.1 仪器设备与试剂

1.1.1 仪器设备

UV 1800紫外-可见分光光度计，岛津（中国）有限公司；KQ 5200超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司；VORTEX-6涡旋振荡器，Qilin Beier；AUW220DASSY分析天平，岛津（中国）有限公司；GI80TW灭菌锅，至微（厦门）仪器有限公司；HFsafe-1500LC生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；LRH-250F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.1.2 试剂

本方法所用试剂均为分析纯；实验用水为二级水。

（1）乙醇溶液（20%，体积分数）：量取200 mL无水乙醇与800 mL水混匀。

（2）氢氧化钠乙醇溶液（0.01 mol/L）：称取0.4 g氢氧化钠，用乙醇溶液溶解并稀释至1 L，混匀。

（3）氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 L，混匀。

（4）盐酸溶液（1 mol/L）：量取83.3 mL盐酸，用水稀释至1 L，混匀。

（5）乳酸杆菌琼脂培养基（BD）：按培养基使用说明书配制。

（6）乳酸杆菌肉汤培养基（BD）：按培养基使用说明书配制。

（7）叶酸测定用培养基（BD）：按培养基使用说明书配制。

（8）叶酸标准品（C19H19N7O6）：纯度≥99%。

（9）菌种为鼠李糖乳杆菌（ATCC 7469）。

1.1.3 标准溶液的配制

（1）叶酸标准储备液（20 μg/mL）：精确称取20.0 mg叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解并转移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀。用紫外-可见分光光度计，在波长256 nm条件下，进行浓度标定并计算得最终浓度。

（2）叶酸标准中间液（0.200 μg/mL）：准确吸取1.00 mL叶酸标准储备液置于100 mL棕色容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀。

（3）叶酸标准工作液（0.200 ng/mL）：准确吸取1.00 mL叶酸标准中间液置于1 000 mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀。

1.1.4 菌株活化

将接种液与甘油按1:1（V:V）比例混合均匀，分装于小离心管，-80 ℃冻存[7]，作为储备菌株。试验前将储备菌株接种至琼脂培养基中，在（37±1）℃恒温培养箱中培养（18±2）h以活化菌株，一般活化2~3 代，不超过5 代，用于接种液的制备。

1.1.5 样品来源

市售婴配粉：某品牌金装婴儿配方奶粉（1段），较大婴儿配方奶粉（2段）和幼儿配方奶粉（3段），每种各2 罐，分别编号为Y1-1，Y1-2，Y2-1，Y2-1，Y3-1，Y3-2。

1.2 试验步骤

1.2.1 样品待测液制备

准确称取婴配粉0.4 g，精确至0.001 g，转入100 mL锥形瓶中，加入80 mL氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡2~4 h至婴配粉完全溶解分散（注意超声清洗机中水的温度，必要时换水），转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。

1.2.2 测定系列管制备

所用试管使用前刷干净，沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡2 h，经（170±2）℃烘干3 h后使用。（1）标准系列管

取试管分别加入叶酸标准工作液0.00 mL、0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL，补水至5 mL，相当于标准系列管中叶酸含量为0.00 ng、0.00ng、0.05 ng、0.10 ng、0.20 ng、0.30 ng、0.40 ng、0.50 ng、0.60 ng、0.80 ng、1.00 ng，再加入5.0 mL叶酸测定用培养基，混匀。制备三套标准系列管。

（2）样品系列管

取3 支试管，分别加入0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL婴配粉稀释液，补水至5 mL，加入5 mL叶酸测定用培养基，混匀。

1.2.3 灭菌

将所有测定系列管具塞，于121 ℃高压灭菌5 min。

1.2.4 接种液制备

取1.1.4的活化菌株，接种于乳酸杆菌肉汤培养基中，（37±1）℃恒温培养6~10 h，后将菌悬液分装至无菌离心管（1.5 mL）中，3 000 r/min离心10 min，倾倒上清液，重复清洗菌体3 次后，加入1 mL灭菌生理盐水复悬菌体，吸取1 mL菌悬液加入10 mL灭菌生理盐水中混匀，即为接种菌悬液。

1.2.5 接种

将灭菌后的样品管和标准管快速冷却至室温后，在无菌操作条件下，接种50 μL于测定系列管中，具塞，混匀。标准管中的空白管分别作接种空白管和接种空白管。

1.2.6 培养

接种后系列管于（37±1）℃恒温培养（20±2）h，直至获得最大浑浊度，即再培养2 h吸光度值无明显变化。

1.2.7 测定

将培养好的标准系列管、样品管用涡旋混匀器混匀，于550 nm处，以未接种空白管为测定空白管，依次测定标准系列管、试样管。以叶酸含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并用样品吸光度值对应标准曲线得出数值，通过公式计算得出叶酸含量。

2 结果与讨论

2.1 线性考察

按1.2.2.1制备标准曲线系列管，以叶酸含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果如表1和图1所示。

表1 叶酸标准曲线数据

从图1看出，该标准曲线的截距值较小，R2=0.994，标曲的线性良好，而且是随着叶酸标准液的浓度增大，吸光度值也增大。由此可得该试验方法的叶酸吸光度值和标准液浓度成正比[8]。

图1 叶酸标准曲线图

2.2 方法精密度试验

2.2.1 日内精密度

对1 份试样检测试验，做10 个平行试验，测试结果如表2所示。

2.2.2 日间精密度

对1 份试样试验，每天做4 个平行试验，做3 天试验，测试结果如表3所示。

由表2和表3可得，RSD值均在3%以下，本试验方法的日内精密度和日间精密度均为良好。

表2 方法日内精密度测试数据

表3 方法日间精密度测试数据

2.3 方法准确度试验

同一试样作为本底，本底含量为80.1 μg/100 g，分别进行3组不同浓度的加标试验，每组做3 个平行试验，计算加标回收率，如表4所示。

由表4可得，通过不同的加标量所得的回收率均在80%~105%的范围内，回收率的平均值均在90%以上，而且RSD值均在3%以下，试验值均比较稳定。

由表4的准确度可得，叶酸优化方法比较稳定，试验误差小，准确率高。

表4 叶酸试样加标测试数据

2.4 方法稳定性试验

分别对某品牌婴儿配方奶粉，较大婴儿配方奶粉及幼儿配方奶粉叶酸的含量测定，结果如表5所示。

表5 不同阶段婴幼儿配方奶粉叶酸的含量

由表5可得，不同阶段婴幼儿配方奶粉叶酸测定含量RSD均在3%以下，故方法稳定性较为良好。

3 小结

本研究是在《GB 5009.211—2014食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》方法的基础上，优化接种液制备的操作步骤，缩短培养液的培养时间而建立的，该法标准曲线R2=0.9943，回收率＞90%，精密度RSD<3%，准确度RSD<3%，稳定性试验RSD<3%，该检测方法标准曲线线性呈现度好，精密度高，准确度高，方法稳定性良好，所需设备简单，操作简便，较大程度地缩短了试验周期，提高了检测效率，为优化微生物法检测叶酸提供依据。