MiR-1290在结直肠癌患者血清中的表达水平及临床意义*

仝松利，崔发财

(1.伊川县人民医院检验科，河南 洛阳 471300；2.河南省人民医院检验科，河南 郑州 450003)

结直肠癌(CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，近年来随着人们饮食模式和生活方式的改变我国CRC发病率呈逐年上升趋势，资料显示，2015年中国CRC新发病例38.76万例，居发病瘤谱的第4位，新增死亡病例18.71万例，居死亡瘤谱的第5位，这给人们的生命健康造成了严重威胁[1-2]，因此迫切需要寻找理想的生物标志物用于CRC的早期诊断、治疗和预后评估。MiRNAs是一类长度19～25 nt的内源性非编码调控RNA，可通过调控转录后水平靶基因的表达参与多种生理病理过程[3]。越来越多的研究表明，miRNA表达异常与肿瘤发生、发展密切相关，由肿瘤组织释放进入循环系统的miRNA能与RNA结合蛋白紧密结合而不易被降解，且能通过常规手段检测[4-6]。因此循环miRNA检测正在成为一种潜在的CRC诊断标志物[7]。本研究将检测miR-1290在CRC患者血清中的表达水平，分析其与CRC临床病理特征的关系，并探讨其对CRC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 连续收集2017年1月至2019年12月在伊川县人民医院经病理确诊的80例CRC患者(CRC组)和40例结直肠腺瘤(CRA)患者(CRA组)的血清样本，以同时期40例体检健康者血清样本作为对照(健康对照组)。CRC患者纳入标准：(1)所有患者均为首次诊断为CRC并进行CRC根治术；(2)既往或现在未患有其他类型的恶性肿瘤疾病或癌前病变，直系亲属中无家族性CRC史；(3)所有患者术前均未接受免疫治疗，未接受放化疗；(4)临床资料完整，且均对本次研究知情同意。CRC排除标准：(1)合并严重自身免疫性疾病；(2)合并心、肝、肺、肾等重要脏器功能不全；(3)直系亲属中既往或现在有2人或2人以上患消化系统恶性肿瘤疾病。CRC组患者中男46例，女34例；年龄21～75岁，平均(52.3±8.3)岁；肿瘤位于直肠47例，结肠33例；肿瘤直径≤4 cm 36例，>4 cm 44例；高-中分化腺癌55例，低分化腺癌25例；有远处转移21例，无远处转移59例；参考国际抗癌联盟(UICC)第8版恶性肿瘤TNM分期标准，Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期36例。本研究经伊川县人民医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集 所有研究对象早晨空腹采集3 mL静脉血，离心(3 000 r/min，离心半径13.5 cm)5 min后，吸取上清液置于不含RNA酶的1.5 mL离心管中，在-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2仪器与试剂 TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司，miScript Ⅱ RT试剂盒和miScript SYBR Green PCR试剂盒均购自德国Qiagen公司，CEA检测试剂盒及配套质控品均购自美国Roche公司，ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，Cobas e601电化学发光(ECL)免疫分析仪购自美国Roche公司。

1.2.3实时荧光定量PCR(qPCR)检测血清miR-1290表达 采用TRIzol试剂提取血清总RNA，采用紫外分光光度仪测量总RNA吸光度(A260 nm/A280 nm)，比值在1.7～2.3的样本用于后续试验。采用逆转录试剂盒对提取的RNA进行逆转录反应试验，RNA稀释至2 ng/μL，加入逆转录溶液，45 ℃环境下逆转录30 min，85 ℃环境下逆转录10 min，反应结束后加入80 μL无RNA酶双纯水进行稀释，将cDNA保存于-20 ℃冰箱。采用荧光定量PCR试剂盒检测miR-1290表达，反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，61 ℃退火30 s，70 ℃ 延伸20 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算血清中miR-1290相对表达水平。引物序列由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成，miR-1290(F)：5′-GCGCGTGGATTTTTGGAT-3′，(R)：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6(F)：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，(R)：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4ECL法检测血清CEA表达 采用ECL免疫分析法测定所有研究对象血清CEA水平，样本检测前应先进行室内质控测量，室内质控合格后按照CEA试剂盒说明书进行检测。

2 结 果

2.13组血清miR-1290及CEA表达水平比较 单因素方差分析显示，血清CRC组患者miR-1290表达水平显著高于CRA组和健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；Cruskal-WallisH检验显示，CRC组患者血清CEA表达水平显著高于CRA组和健康组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组血清miR-1290及CEA表达水平比较

2.2血清miR-1290、CEA表达水平与CRC患者临床病理特征的关系 依据血清miR-1290和CEA表达水平中位数将CRC患者分为miR-1290高表达组、miR-1290低表达组、CEA高表达组和CEA低表达组。χ2检验结果显示，血清miR-1290表达水平与CRC患者TNM分期、肿瘤分化程度和远处转移相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及淋巴结转移无关(P>0.05)；血清CEA表达水平与CRC患者TNM分期和肿瘤分化程度有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、淋巴结转移及远处转移无关(P>0.05)，见表2。

表2 血清miR-1290、CEA表达水平与CRC患者临床病理特征的关系(n=80)

2.3血清miR-1290联合CEA检测对CRC的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，miR-1290诊断CRC的AUC为0.807(95%CI0.863～0.951)，CEA诊断CRC的AUC为0.740(95%CI0.727～0.872)，miR-1290对CRC的诊断效能优于传统的CEA检测。此外，当miR-1290临界阈值为0.96时，CEA临界阈值为3.46 ng/mL时，均能获得最大约登指数，miR-1290的灵敏度和特异度分别为71.2%、80.1%，CEA的灵敏度和特异度分别为68.8%、76.7%。血清miR-1290联合CEA检测诊断CRC的AUC为0.840(95%CI0.907～0.973)，诊断效能优于miR-1290单独检测，当联合检测预测概率的临界阈值为0.738时，约登指数最大，此时灵敏度和特异度分别为88.8%和85.2%，见图1。

图1 血清miR-1290、CEA检测及联合检测ROC曲线分析

3 讨 论

CRC早期发病隐匿，大多数患者就诊时病程往往已进展至中晚期，严重者伴发远距离器官转移，这给临床救治造成了极大困难，患者预后情况较差[8]。CEA是目前临床最常用的CRC筛查肿瘤标志物，对于协助诊断、检测治疗效果和判断预后具有重要意义，但存在灵敏度和特异度低的缺点[9]，并不能有效筛检出潜在CRC患者，因此仍需找寻更有价值的肿瘤生物标志物。

MiRNA是一种内源性非编码调控RNA，在内源性前mRNA的选择性剪接、染色质状态控制、转录和转录后基因调控等方面发挥着重要的调节作用。越来越多研究报道，miRNA表达异常与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关，例如在CRC的研究中，LI等[10]发现miR-4429在CRC组织中低表达，其通过调控SMAD3介导上皮间充质转化抑制CRC细胞的侵袭和迁移，MO等[11]发现miR-452在CRC组织中高表达，其通过抑制血管表皮生长因子A(VEGFA)表达进而调控细胞增殖、细胞迁移和肿瘤血管再生。MiR-1290是新发现的一种微小RNA，其在非小细胞肺癌[12]、食管癌[13]、乳腺癌[14]、CRC[15]等肿瘤组织中的表达水平显著升高，与肿瘤多种恶性生物学性状密切相关。研究发现一些miRNA不仅在肿瘤组织中异常表达，其在肿瘤患者体液中也异常表达，由于其不易受到强酸、强碱影响或不被RNA酶降解，因此循环miRNA正在成为诊断肿瘤的一种新兴的非侵袭性检测手段。血清miR-1290在口腔鳞癌患者中低表达，是影响患者预后不良的独立危险因素[16]，此外，血清miR-1290在胃癌患者中表达升高并与临床病理特征相关，在诊断胃癌方面具有良好的敏感性和特异性[17]。然而，目前尚鲜有血清miR-1290在CRC患者中的表达情况及其在CRC诊断效能方面的研究。

本研究结果发现，血清miR-1290在CRC患者中的表达水平显著高于CRA患者和健康体检者，提示其在CRC的发生、发展中有着重要作用，这与LIU等[18]研究结果相一致。此外，本研究发现血清miR-1290表达水平与CRC患者TNM分期、肿瘤分化程度和远处转移相关，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及淋巴结转移无关，提示血清miR-1290可能与CRC的侵袭转移密切相关。本研究还通过ROC对血清miR-1290诊断CRC效能进行了评估，结果显示miR-1290单独诊断CRC的AUC为0.807，灵敏度和特异度分别为71.2%、80.1%，均优于传统的CEA检测，而当miR-1290与CEA联合检测时，AUC为0.840，灵敏度和特异度分别为88.8%和85.2%，表明血清miR-1290联合CEA检测对CRC诊断有着较好的诊断效能，可以用于CRC的早期筛查。

综上所述，miR-1290在CRC患者血清中高表达且与患者TNM分期、肿瘤分化程度和远处转移相关，血清miR-1290检测可用于CRC早期筛查，miR-1290联合CEA检测可进一步提高CRC诊断效能。