PRKG1在膀胱癌组织中的表达分析和临床意义研究

金露 代光成 朱进 刘晓龙 薛波新

膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤之一，全球范围内每年膀胱癌新发病例约50～55万例，因膀胱癌死亡的病例约20万例[1-2]。近30年来，膀胱肿瘤的临床治疗仍以手术治疗为主，同时行化疗、放疗或其他治疗。然而，即使进行积极的综合治疗，膀胱癌仍有较高的复发率。对于已发生转移的膀胱癌患者，手术不能达到根治切除的目的，包括化疗、放疗、免疫治疗等综合治疗是其主要治疗手段，但治疗效果仍有限[1,3]。因此，寻找可用于预测病情进展的生物标志物，明确膀胱癌的发生、发展机制，是目前临床研究的重点之一。

cGMP依赖性蛋白激酶1(protein kinase cGMP-dependent 1, PRKG1)是cGMP信号通路中重要的作用分子，其在肿瘤中的相关研究较少[4]，膀胱癌中尚无PRKG1相关研究。本研究对在膀胱癌组织中PRKG1蛋白表达进行了检测，并对其临床意义进行了分析探讨。

材料与方法

一、数据获取和临床信息收集

利用开放和可获取数据的癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)、cBioportal数据库(http://www.cbioportal.org)获取PRKG1 mRNA在膀胱癌和癌旁组织中的表达数据，最终获取18对膀胱癌和癌旁正常组织PRKG1 mRNA表达数据。收集于2019年1～12月在本院泌尿外科接受治疗的膀胱癌患者临床信息和保存的石蜡标本，其中膀胱癌标本107例，癌旁正常组织标本19例。标本收集均已获得患者同意并签署知情同意书，本研究项目经苏州大学附属第二医院伦理委员会审批同意。

二、免疫组化检测

取肿瘤组织石蜡切片，经烤片、脱蜡、水化、抗原修复等过程，加入3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶后，加入一抗，4 ℃孵育过夜(12 h)，通用二抗37 ℃孵育30 min，DAB光镜显色，脱水、封片、镜下观察后统计结果。蛋白表达强度采用以下方法计算[5]：在高倍镜下随机选取3个不连续视野进行观察，以细胞质内呈现棕色或者棕黄色颗粒多少作为染色强度(0：阴性；1：弱阳性；2：中等阳性；3：强阳性)；计算阳性染色细胞占总细胞数的百分比，并计分(0分：0；1分：1%～10%；2分：11%～50%；3分：51%～80%；4分：81%～100%)。每个切片二者得分相乘得出最终染色强度评分：0～1分(阴性，以0表示)，2～4分(弱阳性，以+表示)，6～8分(中度阳性，以++表示)，9～12分(强阳性，以+++表示)。

三、细胞系培养及病毒感染

实验所用5637细胞系购自ATCC公司(美国)。细胞培养条件：37 ℃，5% CO2；培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液。含PRKG1序列和对照组的腺病毒载体的构建由上海吉玛公司完成 ，采用荧光法测定病毒滴度。PRKG1过表达组滴度为1×109TU/ml，对照组滴度为0.9×109TU/ml。将细胞接种于6孔板，待细胞融合率达到25%～50%时，将腺病毒载体加入10 μl DMEM培养液，混匀后加入细胞中，继续培养8～12 h后更换培养液。2～3 d后收集细胞，检测PRKG1表达。

四、RT-qPCR检测

收集病毒感染后的细胞，使用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取细胞总RNA。取2 μg总RNA，使用Takara公司PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂逆转录获取cDNA(反应条件：42 ℃，15 min；85 ℃，5 s)，稀释10倍后保存于-80 ℃条件下。以上述cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex TaqTMII试剂完成RT-qPCR反应。反应条件：95 ℃ 1 min；然后95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共计40个循环。采用2-ΔΔCT法分析PRKG1表达水平。PRKG1上游引物：5′-GAGGGCTGGATGATGT-TTCTA-3′；下游引物：5′-GATGTGCTCCTGCTGTCTTGT-3′。GAPDH上游引物：5′- TGACTT-CAACAGCGACACCCA-3′；下游引物：5′- CACCC-TGTTGCTGTAGCCAAA -3′。

五、流式细胞术检测

将感染后的细胞以3×105个/孔的密度接种在6孔板中，24 h后收集细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。 然后使用PBS将细胞重悬，加入5 μl FITC-Annexin V和10 μl PI溶液，将细胞在室温下于细胞悬液中孵育30 min，然后使用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

六、MTT检测细胞活性

将感染后的细胞接种到96孔板中，48 h后向各孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h。然后弃去各孔培养液，向各孔内加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min。采用酶标仪在490 nm处检测各孔吸光度(OD)值并做记录。

七、统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，数据分布差异采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、膀胱癌组织中PRKG1的表达水平

为了确定PRKG1 mRNA和蛋白在膀胱癌和配对的癌旁正常组织中的表达水平，本研究从TCGA数据库下载了膀胱癌PRKG1 mRNA表达数据，包括298例膀胱癌和19例癌旁正常组织，其中配对组织中有效的为18对膀胱癌组织和癌旁正常组织。结果表明，癌组织中PRKG1 mRNA的表达明显低于癌旁正常组织(图1A)。在18对配对组织中，14例癌组织中PRKG1 mRNA的表达低于癌旁正常组织(图1B)。石蜡标本免疫组化染色可以观察到类似的结果，与癌旁正常组织相比，癌组织中PRKG1染色分值较低(图1C)。在配对组织中，14例癌组织中的PRKG1蛋白表达低于癌旁正常组织(图1D)。

A：TCGA数据库中膀胱癌和癌旁正常组织PRKG1 mRNA表达；B：TCGA数据库中18对膀胱癌及癌旁正常组织PRKG1 mRNA表达；C：标本库中膀胱癌和癌旁正常组织免疫组化染色PRKG1蛋白表达统计结果；D：标本库中膀胱癌及配对癌旁正常组织PRKG1表达结果图1 PRKG1在膀胱癌组织中的表达

二、PRKG1表达与膀胱癌患者临床特征的相关性分析

免疫组化结果显示，所有癌组织标本中共有91例标本可检测到PRKG1蛋白表达(85.05%)。其中，患有高级别、较高T分期、肌层浸润性膀胱癌患者的PRKG1蛋白表达水平较低(表1)。

表1 PRKG1蛋白表达水平和标本库患者临床特征相关性分析(例)

三、PRKG1调节膀胱癌细胞的增殖和凋亡

膀胱癌细胞(5637)过表达PRKG1后，采用RT-qPCR检测PRKG1 mRNA表达，结果显示PRKG1过表达组表达量为对照组的(328.99±44.81)倍(P<0.001，图2A)。MTT结果显示，过表达PRKG1后，膀胱癌细胞增殖明显抑制[PRKG1过表达组OD值(0.75±0.15)，对照组OD值(0.93±0.12)，图2B]；流式细胞术检测结果显示，过表达PRKG1后，细胞凋亡比例明显增加[PRKG1过表达组细胞凋亡率(8.60±0.12)%，对照组细胞凋亡(3.85±0.53)%，图2C]，表明在膀胱癌细胞中过表达PRKG1可抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

A：PRKG1过表达组细胞PRKG1表达明显升高；B：MTT结果表明PRKG1过表达组细胞增殖受到抑制；C：流式细胞术检测结果表明PRKG1过表达组细胞凋亡率高于对照组图2 PRKG1对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

讨 论

目前的研究发现，PRKG1在正常平滑肌细胞中表达较高，而在多种肿瘤中表达水平较低[6]。Hou等[6]的研究结果表明，在肝癌、胰腺癌、睾丸肿瘤、结肠癌和甲状腺癌中PRKG1表达均有下降。进一步的PRKG1在肿瘤中的功能研究表明其对肿瘤的发生、发展具有抑制作用[7-8]。结肠癌中的相关研究结果显示，PRKG1可抑制结肠癌细胞在动物体内的生长和转移，具体机制为PRKG1的过表达可通过MEKK1/SEK1通路激活JNK1，从而诱导细胞凋亡[7]。在乳腺癌细胞中，PRKG1可以通过抑制致癌性Wnt/β-catenin介导的转录而抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡[8]。本研究发现PRKG1在膀胱癌组织中的表达较正常膀胱组织下降，且临床标本中的检测结果显示低表达PRKG1患者的肿瘤分期、分级均较高，表明PRKG1表达下降和膀胱癌进展密切相关。

膀胱癌的免疫治疗和靶向治疗是近年来的研究热点，主要机制涉及细胞周期调控、DNA损伤修复、改变细胞极性、调节细胞自噬、代谢等[9-11]。Su等[12]的研究发现，膀胱癌组织中环状RNA circELP3表达明显升高，且高circELP3表达和肿瘤淋巴转移具有相关性。进一步的细胞实验和动物实验结果表明，缺氧条件可诱导膀胱癌细胞产生circELP3，而敲低circELP3表达可抑制裸鼠体内膀胱癌细胞移植瘤的生长。另有研究发现，DAB2IP在膀胱癌组织中表达下降，且低DAB2IP表达和较高的肿瘤分期、复发具有相关性，细胞实验结果提示下调DAB2IP可能通过激活ERK通路和细胞EMT发挥促癌作用[13]。本研究结果表明过表达PRKG1具有抑制膀胱癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用，提示PRKG1可能是膀胱癌生物治疗潜在的靶点之一，但其具体作用机制有待进一步探索。后续将开展动物体内实验，探讨PRKG1作为膀胱癌生物治疗靶点的可行性，并分析其具体作用机制。

目前临床工作中应用的膀胱癌生物标志物较少，且特异性不高。本研究发现，PRKG1蛋白的表达与肿瘤级别和肌层浸润明显相关，具有一定临床意义，但本研究的病例数较少，且为回顾性研究。后续将开展前瞻性研究，扩大样本量，纳入肿瘤分期、分级等因素进行多因素分析，进一步探索PRKG1的临床意义，分析其用于膀胱癌预后判断和病情监测的临床价值。

总之，PRKG1在膀胱癌组织中表达下降，与膀胱癌临床分期、分级相关，体外实验表明PRKG1可调控细胞增殖、凋亡。但PRKG1在膀胱癌中发挥作用的具体分子机制尚不明确，有待进一步研究。