金橘抗氧化活性谱效关系

邓华明，黄华花，陈景海，王晓莹

1. 广东岭南职业技术学院护理与健康学院（广州 510663）；2. 厦门医学院药学系/厦门市中药生物工程重点实验室/福建省中药精加工与健康产品开发重点研究室（厦门 361023）；3. 厦门大学附属妇女儿童医院，厦门市妇幼保健院中药房（厦门 361003）

随着人们对安全性的要求不断提高，从中药中寻求天然抗氧化剂倍受关注，测定其抗氧化活性也成为抗氧化研究的热门话题。

金橘（kumquat），为芸香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的果实，是一种具有很大开发潜力的药用保健资源。《中华本草》记载，金橘具有理气解郁、消食化痰、醒酒的功效[1]。现有研究表明[2-6]，金橘具有抗氧化作用，挥发油、萜类、黄酮类、多糖类、甾醇类等化学成分是金橘抗氧化作用的重要物质基础[7]。

金橘的抗氧化研究仅局限于有效部位，而各部位化学成分复杂，抗氧化活性成分的筛选研究工作量大，因此试验在前期金橘指纹图谱研究的基础上[8]，探讨金橘抗氧化活性的谱效关系，初步筛选与抗氧化活性密切相关的组分，为后期金橘抗氧化活性成分的筛选研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific Oy Ratastie 2，F1-01620 Vantaa，Finland）；电子天平CP124C[奥豪斯仪器（上海）有限公司]。

过硫酸钾、甲醇（分析纯，西陇科学股份有限公司）；2, 2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐、1, 1-二苯基-2-苦基肼（上海源叶生物科技有限公司）；维生素C[石药集团维生药业（石家庄）有限公司]。药材信息见表1，经厦门医学院鲍红娟副教授鉴定为金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]正品。

表1 金橘的样品信息

1.2 研究方法

1.2.1 供试品溶液配制备

金橘果实，粉碎，过0.425 mm（40目）筛，精密称定0.5 g，加25 mL 75%甲醇，称定，超声（900 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定，补足，摇匀，滤过，即得。

1.2.2 DPPH自由基清除能力测定[9]

1.2.2.1 DPPH溶液配制

取适量DPPH，精密称定，加75%甲醇溶解并制成质量浓度0.04 mg/mL的DPPH储备液[10]。

1.2.2.2 DPPH自由基清除能力的测定及IC50的计算

将供试品S1～S8的质量浓度设定为5.000，2.500，1.250，0.625，0.313和0.156 mg/mL，维生素C溶液作为阳性对照溶液。分别取维生素C溶液、供试品溶液各100 μL，加100 μL DPPH溶液，置96孔板中，混匀，室温避光30 min。在517 nm波长处测定吸光度Ai，同时测定各供试品溶液100 μL+75%甲醇100 μL的吸光度Aj，75%甲醇100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度A0，清除率按式（1）计算。

因不同浓度供试品的自由基清除率与浓度不呈线性，故使用SPSS Statistics 24中Probit方法进行回归，拟合方程Probit（P）=截距+Bx，通过卡方检验得到IC50值。

1.2.3 ABTS自由基清除能力测定[11]

1.2.3.1 ABTS溶液配制

分别取适量ABTS、K2S2O4，精密称定，用蒸馏水溶解并制成浓度7 mmol/L的ABTS和350 mmol/L K2S2O4溶液。取440 μL K2S2O4溶液加入到ABTS溶液中，摇匀，避光12～16 h，用75%甲醇稀释至吸光度0.6～0.8。

1.2.3.2 ABTS自由基清除能力的测定及IC50的计算

供试品浓度的设定见表2。按1.2.2.2的方法在波长734 nm下测定，计算清除率及IC50。

表2 8批金橘样品的质量浓度

1.2.4 灰色关联度分析法

通过Excel处理数据[12]，采用GRA法对8批金橘样品指纹图谱共有峰峰面积数据和自由基清除作用做统计分析，研究两者的相关性。将各批次药材的IC50设为母序列，将24个共有峰设定为子序列，1～24个共有峰分别用X1～X24表示[13]。

1.2.4.1 原始数据无量纲化

母序列、子序列分别定为A0(m)、Ai(m)，平均值分别定为，数据均值化处理，按式（2）和（3）计算，得均值化数列，新的数据中，母序列、子序列分别定为Y0(m)、Yi(m)。

1.2.4.2 求绝对差序列

按式（4）计算，得绝对差序列Δσi(m)。

1.2.4.3 求关联系数

山东运河区域，一般是指明清时期，京杭大运河流经山东境内的部分州县及其辐射地带，大致包括今天的枣庄、济宁、聊城等3个地级市，包含德州的德城、陵县、武城、夏津、平原等县级地区，以及菏泽市东部单县、巨野、运城，泰安市的东平县，济南市的平阴县等近40个县市。明代以前，在京杭运河的重要组成部分“会通河”疏浚之前，山东运河区域的社会经济水平与临近的华北地区差别不大。随着几代统治者的大力开凿、疏浚和重整，从元末明初到之后将近400余年的时间里，随着运河航运的便利，山东运河区域的烟草生产、棉花种植、果品栽培等活动也因大运河的南北通达、易于转售而促使地方经济获得了结构性的调整和跃升。

按式（5）计算，得相应的关联系数L0i(k)。其中，Δmin为最小值，Δmax为最大值，ρ为分辨系数（ρ= 0.5）。

1.2.4.4 计算关联度

按式（6）计算，得关联度R0i。其中，N为数据个数。

1.2.4.5 排关联序并进行谱效相关性

将关联度进行排列，形成关联序，反映各个子序列对母序列的“贡献”程度。由此可确定指纹图谱共有峰所代表的化学成分与抗氧化活性间的联系。

1.2.5 偏最小二乘回归分析法

利用SIMCA-P 14.1软件，将金橘样品指纹图谱共有峰的峰面积与金橘的IC50进行PLSR分析，将共有峰峰面积定为X，药材IC50定为Y。1～24个共有峰分别用X1～X24表示[14]。

1.2.5.1 建立工程，指定工作集

1.2.5.2 指定模型，进行拟合

建立工程后，系统根据用户已指定的因变量Y，也就是各批金橘样品的IC50自动生成PLSR模型。

1.2.5.3 预测分析

拟合模型后，指定预测数据集，进行拟合分析，得出结果。

2 结果与分析

2.1 前期指纹图谱研究[8]

前期指纹图谱研究得8批金橘样品的UPLC图谱，见图1。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行分析，确定共有24个峰，见图2。

图1 8批金橘样品的UPLC叠加指纹图谱

图2 8批金橘样品的UPLC对照指纹图谱

2.2 DPPH自由基清除能力测定

2.2.1 金橘样品对DPPH自由基的清除能力测定结果

8批金橘样品对DPPH自由基的清除能力测定结果见图3和图4。结果显示，8批金橘样品均表现出良好的DPPH自由基清除能力，而且清除作用随着金橘供试品质量浓度的升高而增强，同时S3和S8分别表现出相对最强和相对最弱的抗氧化作用，抗氧化活性的强弱顺序为S3＞S4＞S7＞S1＞S2＞S5＞S6＞S8。

图3 8批金橘样品和VC对DPPH自由基的清除能力

图4 8批金橘样品和VC的DPPH自由基清除作用IC50

2.2.2 金橘指纹图谱与DPPH自由基清除能力的谱效关系分析

2.2.2.1 灰色关联度分析

GRA分析结果，见表3。根据关联序，确定各色谱峰对金橘抗氧化作用贡献的大小，依次为X2＞X1＞X9＞X14＞X6＞X12＞X19＞X11＞X10＞X16＞X15＞X5＞X22＞X3＞X17＞X23＞X4＞X20＞X24＞X18＞X8＞X21＞X13＞X7，其中X2、X1、X9、X14、X6、X12、X19、X11、X10、X16的相对关联度均大于0.65，对清除自由基作用的贡献较明显。

表3 金橘样品UPLC指纹图谱与清除DPPH自由基活性关联度

2.2.2.2 偏最小二乘回归分析

PLSR分析结果，见图5。拟合回归方程：Y=-0.112X1-0.244X2-0.029X3+0.066X4-0.057X5+ 0.062X6+0.010X7+0.034X8-0.167X9-0.242X10+ 0.111X11-0.165X12+0.050X13-0.064X14-0.045X15- 0.001X16+0.053X17-0.005X18-0.291X19+0.078X20+ 0.001X21-0.013X22+0.008X23-0.041X24。相关系数的绝对值反映对金橘抗氧化作用的贡献，绝对值越大，对金橘抗氧化贡献越大；反之，绝对值越小，对金橘抗氧化作用贡献越小。其中，色谱峰X1、X2、X3、X5、X9、X10、X12、X14、X15、X16、X18、X19、X22、X24呈负相关，因IC50与金橘的抗氧化作用呈负相关，所以这些色谱峰对金橘抗氧化作用有贡献。

图5 8批金橘样品的PLSR标准化相关系数图和VIP值图

变量投影（VIP），是直接反映金橘指纹图谱中的各色谱峰对金橘抗氧化活性贡献程度的一个参数，VIP值越大，说明该峰所代表的化合物对金橘抗氧化作用的影响程度越高，VIP＞1时，表示对金橘抗氧化作用有显著贡献。色谱峰X19、X2、X9、X12、X10、X1、X14、X5的VIP值＞1，因此，金橘样品指纹图谱中X1、X2、X5、X9、X10、X12、X14所代表的化合物，可能为金橘抗氧化活性的物质基础。

2.3 ABTS自由基清除能力测定

2.3.1 金橘样品对ABTS自由基的清除能力测定结果

8批金橘样品对ABTS自由基的清除能力测定结果见图6和图7。结果显示，8批样品均对ABTS自由基表现出明显清除作用，且清除作用随质量浓度升高而增强，同时S1和S8分别表现出相对最强和相对最弱的抗氧化作用，抗氧化活性的强弱顺序为S1＞S3＞S4＞S2＞S5＞S6＞S7＞S8。

图6 8批金橘样品和VC对ABTS自由基的清除能力

图7 8批金橘样品和VC的ABTS自由基清除作用IC50

2.3.2 金橘指纹图谱与ABTS自由基清除能力的谱效关系分析

2.3.2.1 灰色关联度分析

GRA分析结果，见表4。依据关联序，确定各色谱峰对金橘抗氧化作用贡献程度，顺序依次为X19＞X2＞X16＞X20＞X17＞X23＞X22＞X24＞X21＞X8＞X18＞X3＞X13＞X15＞X5＞X11＞X10＞X1＞X4＞X6＞X7＞X5＞X14＞X19，其中X19、X2、X16、X20、X17、X23、X22、X24、X21的相对关联度均大于0.8，对清除自由基作用的贡献较明显。

表4 金橘样品UPLC指纹图谱与清除ABTS自由基活性关联度

2.3.2.2 偏最小二乘回归分析

PLSR分析结果，见图8。拟合回归方程：Y= -0.066X1-0.612X2-0.034X3+0.272X4+0.090X5+0.231X6- 0.000 2X7-0.546X8+0.095X9-0.356X10+0.005X11+ 0.003X12+0.028X13-0.223X14+0.156X15-0.111X16+ 0.066X17-0.126X18-0.241X19+0.094X20-0.068X21+ 0.004X22+0.099X23+0.020X24。回归系数为负数的色谱峰是抗氧化能力的贡献峰，其中，色谱峰X1、X2、X3、X7、X8、X10、X14、X16、X18、X19、X21呈负相关，对金橘抗氧化作用有贡献。

图8 8批金橘样品的PLSR标准化相关系数图和VIP值图

色谱峰X2、X19、X10、X8、X1、X14、X11的VIP值＞1，因此，金橘样品指纹图谱中X1、X2、X8、X10、X14、X19代表的化合物可能为金橘抗氧化活性的物质基础。

3 讨论与结论

3.1 分析方法的选择

灰色关联度分析法是衡量各因素之间关系的统计方法，对数据的要求较为低，而且可以减少由于数据不对称带来的影响，偏最小二乘回归分析法是集多种方法于一身的统计方法，可以较好地解决样本少于变量个数的问题。这2种方法都是通过统计各色谱峰峰面积与药效间的联系，评价两者的相关性和贡献值大小的统计方法，上述2种方法均是构建中药谱效关系常用、有效的方法，同时选用2种方法进行分析，结果更全面、客观。

3.2 DPPH储备液浓度的确定

预试验过程中，制备的DPPH储备液质量浓度为0.08 mg/mL，此时所测得的金橘供试品均未表现出抗氧化活性，说明可能DPPH储备液浓度过高，导致各浓度金橘供试品自由基清除率偏低，未表现出良好的抗氧化活性，因此将DPPH储备液的质量浓度调整为0.04 mg/mL，结果表现出良好的抗氧化活性。

试验在前期指纹图谱研究的基础上，通过DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法评价8批不同产地的金橘样品的抗氧化活性，采用GRA和PLSR构建金橘抗氧化活性的谱效关系。GRA和PLSR结果均表明，X2、X19的峰面积与DPPH和ABTS自由基清除能力呈正相关，可能为金橘抗氧化的贡献峰，其代表的化合物可能为金橘抗氧化活性的药效物质基础。该试验为后期金橘抗氧化活性成分的筛选研究提供参考，为金橘的深度研究及产业化应用奠定基础。