响应面优化石榴汁酶解工艺

潘红军，茹先古丽·买买提依明，邢军，艾合买提江·艾海提*，秦新政，刘军*

1. 新疆大学生命科学与技术学院（乌鲁木齐 830017）；2. 新疆农业科学研究院微生物应用研究所（乌鲁木齐 830011）

石榴（Punica granatumL.）为石榴科石榴属落叶灌木或者小乔木，又名安石榴、丹若、金婴等，是一种珍奇的浆果，原产于伊朗、阿富汗等中西亚地区[1]。它长期以来一直是中东和地中海饮食的一部分。罗马人称它为布尼克苹果[2]。石榴的种植分布于美国、中国、巴西、土耳其等国家。在中国大面积种植于新疆喀什、安徽怀远、陕西临潼、四川会理、云南蒙自、山东枣庄等[3]。石榴根据其口感的不同分为甜石榴和酸石榴2个大类，我国的石榴品种有100多种，作为食用的甜石榴就有90多种。石榴的果实器官包括果皮、隔膜、假种皮及石榴籽。假种皮也就是石榴的食用部分，富含水分和花色苷。花色苷含量占比决定假种皮的颜色不同。石榴汁是从假种皮中获得的主要食品，约占水果总质量的50%[5]。石榴汁呈红紫色，中等酸性，平均含85.4%的水分和14.6%的干物质。研究发现石榴汁具有抗氧化[6]、抗炎[7]、抗菌[8]、抗骨质疏松[9]、抗癌[10]等生理功效。

为增加果汁的产量及得到营养物质含量丰富的果汁，普遍采用酶解技术对果汁进行加工。孙小华等[11]以果胶酶和纤维素酶进行酶解，无花果的出汁率达到72.15%，相对于未处理的提高75.46%。除了经常在果汁加工使用的酶，如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等，蛋白酶也逐渐被使用于果汁酶解。孙俊杰等[12]以果胶酶和酸性蛋白酶作为复合酶处理浊橙汁，果汁的出汁率达到83.27%。试验以果胶酶和木瓜蛋白酶作为复合酶确定澄清石榴汁的最佳酶解条件，并对其工艺采用响应面设计进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴（购于新疆喀什，运回后储藏于4 ℃冰箱）；果胶酶（上海源叶生物技术有限公司）；木瓜蛋白酶（上海源叶生物技术有限公司）；碳酸钠（分析纯，上海源叶生物有限公司）；氯化钾（分析纯，上海源叶生物有限公司）；乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

XY-25B-13B型榨汁机（佛山市南海区九阳厨具厂）；SPECORD PLUS型紫外分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）；JE3002型电子天平（上海蒲春计量仪器有限公司）；H2-16K台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；AUW120型电子天平（岛津菲律宾工厂）；DZKW-2-12型数显恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴汁酶解工艺

取若干石榴洗净去皮去除隔膜，用榨汁机压榨获得石榴汁。准确称取25 g石榴汁于锥形瓶中，加入一定量的果胶酶与木瓜蛋白酶（W果胶酶∶W木瓜蛋白酶=1∶1）。将锥形瓶置于水浴锅中提供相应的条件使其开始酶解。酶解完后于65 ℃灭酶3 min，以8 000 r/min离心8 min获得上清液即为石榴汁。

1.3.2 酶解单因素试验

1.3.2.1 酶添加量对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响

设定酶解时间60 min、酶解温度45 ℃，比较不同复合酶添加量（0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%）对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响。

1.3.2.2 酶解时间对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响

设定复合酶添加量0.2%、酶解温度45 ℃，比较不同酶解时间（30，60，90，120和150 min）对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响。

1.3.2.3 酶解温度对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响

设定酶解时间60 min、复合酶添加量0.2%，比较不同酶解温度（30，35，40，45和50 ℃）对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响。

1.3.3 响应面优化设计

优选单因素试验的结果，采用Design Expert 11.0进行响应面试验设计、计算，从而确定最佳复合酶酶解石榴汁工艺，试验设计因素水平如表1所示。

表1 石榴汁响应面编码因素水平表

1.3.4 指标的测定

澄清度测定。取离心后的石榴汁上清液在660 nm处测定透光度，纯水为对照，以透光率（%）表示。

花色苷含量测定，采用pH示差法。吸取一定的石榴汁，分别用pH 1.0的缓冲溶液（125 mL 0.2 mol/L氯化钾与375 mL 0.2 mol/L盐酸混匀）和pH 4.5缓冲溶液（200 mL 1 mol/L乙酸钠、120 mL 1 mol/L盐酸和180 mL水混匀）稀释10倍，分别在510 nm和700 nm下测其吸光度。按式（1）和（2）计算花色苷含量（CGE mg/L）。

式中：A510和A700为果汁在波长510 nm和700 nm下的吸光度；A为不同pH环境下吸光度的差值；MW为矢车菊3-葡萄糖苷的分子量，449.2；F为稀释倍数，10；ε为矢车菊3-葡萄糖苷的消光系数，26900。

1.4 数据处理

数据采用Excel和Design Expert 11.0进行处理，使用Graph pad prism作图。

2 结果与分析

2.1 单因素结果与分析

2.1.1 酶添加量的影响

如图1所示，随着复合酶添加量增加，石榴果汁的澄清度呈现先增加后降低趋势。复合酶添加量达到0.2%时，石榴汁的澄清度达到最高，其平均值为78.53%。酶添加量大于0.2%时，石榴汁的澄清度逐渐降低，这可能是因为酶添加量过大后，随着大分子物质被分解为小分子物质，如果胶被分解为单糖[13]，如葡萄糖、果糖；蛋白质被分解为小分子肽或者氨基酸类物质。水溶性小分子物质的增多及分子间的相互键合形成络合物也可导致石榴汁的澄清度下降[14]。也可能是因为酶添加量过多，蛋白类物质增多，导致果汁浑浊[15]。花色苷含量随着酶添加量增加呈现逐渐降低趋势，该趋势与聂铭等[16]的研究结果一致。酶解时花色苷含量从115.322 CGE mg/L降低到93.113 CGE mg/L，降低19.27%。花色苷作为与颜色表现紧密相关的活性物质，花色苷的降低也就会影响果汁颜色的变化，蒋朵朵等[17]的研究证明花色苷含量的变化与植物本身颜色的变化具有显著相关性。由此，为获得澄清型的石榴汁，最佳酶添加量为0.2%。

图1 酶添加量对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响

2.1.2 酶解时间的影响

如图2所示，石榴汁的澄清度随着酶解时间增加呈现先增大后降低趋势。酶解时间60 min时石榴汁的澄清度达到最大值78.69%。时间小于60 min时，石榴汁的澄清度不高可能是因为酶与底物作用不完全，大分子物质不能完全分解，使得澄清效果不理想。酶解时间超过60 min后澄清度下降可能是由于果汁中的物质发生络合反应使得果汁的澄清度降低。花色苷含量随着酶解时间增加呈现先增加后降低趋势，最高达到176.270 CGE mg/L。其原因是花色苷作为大分子多酚类化合物，容易发生氧化反应和水解反应，长时间的酶解容易造成花色苷的氧化及水解。因此为了保留更多的花色苷，应该降低酶解时间。综合考虑，选择60 min作为最佳酶解时间。

图2 酶解时间对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响

2.1.3 酶解温度的影响

如图3所示，随着温度逐渐升高，石榴汁的澄清度呈现先增加后降低趋势。酶解温度35 ℃时，石榴汁的澄清度达到最大值。温度较低时，可能是由于未达到复合酶的最佳温度，酶解效率降低，使得果汁澄清度不高。温度大于35 ℃时，澄清度逐渐降低，因为酶的本质为蛋白质，温度的升高引起酶的活性降低甚至失活，造成石榴汁的澄清度随着温度升高而递减。而花色苷含量变化呈现随温度升高而逐渐降低趋势，由107.840 CGE mg/L降低到94.532 CGE mg/L。其原因是石榴花色苷的耐温性不高，温度升高造成花色苷的分解及氧化生成其他化合物，使得花色苷含量降低[18]。因此在使用复合酶酶解石榴汁时最佳酶解温度为35 ℃。

图3 酶解温度对石榴汁澄清度和花色苷含量的影响

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 结果与模型建立

根据2.1的试验结果，按照表1的因素与水平编码进行Box-Behnken试验设计，其响应值为石榴汁酶解后的澄清度（Y），试验结果如表2所示。

由表2的响应面试验结果，经过Design Expert 11.0软件二次多项式回归分析，得到石榴皮澄清度（%）对应的酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）的回归曲线方程：Y=-27.255+29.09A+ 0.442 95B+4.720 3C-0.020 833AB+0.975AC-0.000 217BC- 129.975A2-0.002 377B2-0.068 390C2。

表2 复合酶酶解石榴果汁响应面结果表

2.2.2 方差分析以及显著性检验

通常使用F值和P值检验回归方程各因素的显著性水平，表达各变量间的相互影响大小，P＜0.01表示模型具有极大的可信度。由表3中各F值可判断各因素对响应值的影响大小，则其影响大小由大到小的排列顺序为C＞A＞B。由P＜0.000 1可知该模型可以很高程度对复合酶酶解石榴汁进行模拟，而且该试验失拟项不显著（P＞0.05），失拟项一般被用于验证试验模型是否与理论模型相符合。由其结果则可知该模型拟合度好，不会造成较高的试验误差。

表3 二次多项式回归方程方差分析和显著性检验结果

同时可根据表3中的P值判断各因素对澄清结果的影响显著程度，其中PA=0.019 2（P＜0.05）表示因素A（酶添加量）对澄清度的影响显著，同理PC=0.008 8（P＜0.01）表示因素C（酶解温度）对澄清度的影响极显著，而PB=0.936 4（P＞0.05）则说明因素B（酶解时间）对澄清度的影响不显著。

2.2.3 响应面分析与优化

对于响应面的分析就是采用平面等高线图与三维立体图来分析，平面等高线的曲线越接近于椭圆表示2个因素的交互影响作用越显著，而在三维立体图中，曲线的坡度越陡则表示两个因素的交互影响作用越显著[19-20]。由表3和图4可知，交互项AC对响应值Y影响显著（P＜0.05），剩余交互项AB、BC对响应值Y影响均不显著。

图4 响应面各因素交互作用三维图

2.3 最佳酶解参数及验证

由试验模型可知，预测的最佳工艺为复合酶添加量0.214%、酶解时间60.468 min、酶解温度35.743 ℃，此时石榴汁的透光率为79.954%。基于试验的容易操作性及提取效果的可行性，将数据调整为复合酶添加量0.22%、酶解时间60 min、酶解温度35 ℃，此时石榴汁澄清度为77.94%，花色苷含量为174.154 CGE mg/L。理论值与实际数据误差较小，则可视为该模型与实际拟合良好，可以使用。

3 结论

为获得澄清型的石榴汁，以酶解工艺对石榴汁进行澄清，测定酶解工艺对石榴汁透光率以及花色苷含量的影响。在单因素试验基础上，利用响应面对石榴汁酶解工艺进行优化，获得与实际较为拟合的模型。最佳石榴汁酶解工艺条件为复合酶添加量0.22%、酶解温度35 ℃、酶解时间60 min，在此工艺条件下石榴汁的澄清度达到77.94%，花色苷含量为174.154 CGE mg/L。试验可为石榴汁的加工提供基础数据。