乳酸菌制剂对全株玉米青贮发酵品质、有氧稳定性及瘤胃降解特性的影响

游 伟, 赵红波△, 陶海英, 陈祥兴, 万发春, 王星凌, 张相伦*

(1.山东省农业科学院 畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室/山东省肉牛生产性能测定中心，山东 济南 250100；2.淄博市畜牧渔业服务中心，山东 淄博 255000)

全株玉米青贮是反刍动物重要的饲料原料，具有营养价值高、适口性好、贮存时间长等优点，广泛应用于饲养生产中。近年来，随着中国“粮改饲”政策的实施和推广，全株玉米青贮饲料的制作量连年升高，与此同时，其品质和质量安全也越来越受到关注。生产制作优质的玉米青贮对于保障动物健康、提高生产性能和养殖效益至关重要。

据报道，2019年中国全株玉米青贮饲料质量85%以上达到良好水平，但仍存在青贮饲料技术支撑能力与服务不足等制约问题，如何制作优质的玉米青贮仍是业内关注的热点。

在青贮制作过程中使用添加剂是生产中常用的技术手段，青贮添加剂种类较多，包括微生物制剂、酶制剂、有机酸及其盐等。适宜的青贮添加剂可以改善青贮品质、提高消化率、改善动物生产性能，其中以乳酸菌为主的复合菌剂因在提高青贮品质、减少养分损失等方面具有安全高效的特点而备受关注。根据发酵类型，乳酸菌可分为同型和异型发酵乳酸菌，前者能将碳水化合物发酵成乳酸，通过降低青贮pH抑制有害微生物的滋生；后者除产生乳酸外，还可产生乙酸、乙醇等，可有效抑制青贮开窖后真菌的滋生，提高有氧稳定性。研究发现，将二者进行复配应用可协同提高青贮的饲用价值，但已有报道在乳酸菌的添加量、对青贮消化特性和有氧稳定性的改善等方面仍存在差异报道，需进一步研究。

本课题组前期发现，添加复合乳酸菌制剂可提高发酵第45、60 d的全株玉米青贮的品质，但高剂量乳酸菌制剂效果反不理想，且从结果上看短期发酵的青贮状态仍不稳定。基于此，为进一步明确复合乳酸菌制剂的适宜添加量和对全株玉米青贮营养价值的调控效果，本研究拟在前期基础上，继续探讨复合乳酸菌制剂对全株玉米青贮发酵品质、营养成分、有氧稳定性和瘤胃降解特性的影响，以期为中国优质全株玉米青贮的制作提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮原料为山东省济南市历城区蜡熟期刈割的新鲜全株玉米(登海605)，营养成分为：干物质(DM)26.33%，有机物(OM)93.11%，粗蛋白质(CP)9.62%，中性洗涤纤维(NDF)65.01%，酸性洗涤纤维(ADF)30.25%(DM基础)。选用的青贮袋规格为77 cm×44 cm，包含内外2层，外层为聚丙烯材料，内层为聚乙烯材料，保证青贮过程中不漏气。乳酸菌制剂(11CFT,加拿大Pioneer Hi-Bred公司)，每克含1.1×10CFU(Colony Forming Unit)乳酸菌，包括布氏乳杆菌和干酪乳杆菌。

1.2 试验设计

选取新鲜全株玉米360 kg，用青贮切碎机切短至2 cm，混合均匀后备用。试验分为4个组，每组6个重复，每个重复15 kg。1组为对照组，每个重复喷雾添加45 mL无菌生理盐水，2～4组为试验组，每个重复分别喷雾添加2、10和20 mg/kg的乳酸菌制剂(预先稀释于45 mL无菌生理盐水中)。各自混合均匀后将青贮快速装填并压实于青贮袋中，排出空气后置于室温下密封避光发酵90 d，之后开袋取样测定相关指标。

1.3 样品采集及指标测定

1.3.1 微生物数量 取新鲜样本50 g，加入到盛有450 mL无菌生理盐水的样品瓶中，充分搅拌后将此溶液稀释10～10倍数。微生物数量采用平板计数法测定，乳酸菌用MRS琼脂培养基进行计数，霉菌采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行计数(每个平板上菌落数控制在30～300个之间为有效)。

1.3.2 发酵指标测定 每重复准确称取20 g新鲜全株玉米青贮样本，加入180 mL蒸馏水，匀浆60 s后用4层纱布过滤，立即使用pH计(HI9025,意大利Hanna Instruments)测定pH。另取青贮样本50 g，加入100 mL去离子水，匀浆后通过4层纱布和定性滤纸过滤，所得的液体为青贮滤液，置于-20 ℃冰箱保存待测乳酸(LA)、挥发性脂肪酸(VFA)和氨态氮(NH-N)含量。LA含量采用对羟基联苯法测定。VFA(包括乙酸、丙酸和丁酸)含量采用高效气相色谱仪(GC-2010，日本岛津)进行测定。

1.3.3 营养成分测定 分别取各重复新鲜全株玉米青贮制备风干样本，DM和CP含量采用AOAC(2005)方法测定，NDF和ADF含量采用Van Soest等(1991)的方法测定。淀粉(Starch)含量采用高氯酸水解-蒽酮比色法测定。NH-N含量采用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定。水溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮硫酸比色法测定。

1.3.4 有氧稳定性测定 参考Nishino等和Ranjit等的方法测定全株玉米青贮的有氧稳定性。主要步骤如下：发酵90 d后，每重复采集3 kg全株玉米青贮于泡沫保温箱中置于室温条件(25 ℃)下有氧暴露，在每个泡沫保温箱上层覆盖双层纱布防止干燥和污染，将温度计插入青贮的几何中心内部，每8 h记录一次温度变化。另取每重复3 kg全株玉米青贮于泡沫保温箱中有氧暴露，每天混合均匀后采样测定青贮的pH和霉菌数量变化。

何良诸也觉得饿了。井上大概发生了重大变故，如果小勺酒店被围抄，警方将赵集、小勺、驼子带走，他们会活活饿死。何良诸将上面的情况，告诉了两位难兄难弟。

1.3.5 瘤胃降解率测定 选用4头体况良好的安装永久性瘤胃瘘管的利木赞×鲁西黄牛杂交牛(500 ± 25 kg)，试验饲粮(DM基础)为：全株玉米青贮45.0%，羊草15.0%，玉米27.0%，豆粕7.4%，DDGS 4.0%，氯化钠0.4%，小苏打0.4%，石粉0.4%，预混料0.4%；营养水平为：综合净能6.23 MJ/kg，CP 12.66%，NDF 45.74%，ADF 24.22%。每天饲喂两次(6:00和18:00)，自由饮水。采用尼龙袋法检测全株玉米青贮的瘤胃降解特性，尼龙袋规格为12 cm×6 cm，孔径为50 μm，准确称取2 g左右样品装入尼龙袋，每个样品每个时间点设5个重复，投入前将每个时间点尼龙袋绑到一起，投入瘤胃后将牵引绳固定于瘘管外侧，分别于投放后24 h、48 h和72 h取出尼龙袋，使用自来水冲洗至澄清后置于65℃烘箱中烘干，测定样品的DM、CP、NDF和ADF含量，计算降解率，公式如下：

营养物质降解率/%=[(消化前样品营养物质含量-消化后样品营养物质含量)/消化前样品营养物质含量]×100

1.4 数据处理

试验数据经Excel 2016初步整理后，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性检验，采用Tukey's法进行多重比较，并对所有组进行一次和二次效应分析，结果以平均值(Mean)和平均值标准误(SEM)表示，<0.05为差异显著，0.05<<0.1表示有变化趋势。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌制剂对全株玉米青贮微生物数量的影响

由表1可知，乳酸菌制剂组乳酸菌数量显著高于对照组(<0.001)；随着乳酸菌制剂添加量的升高，全株玉米青贮的乳酸菌数量呈一次(<0.001)和二次(<0.001)增加，说明乳酸菌数量随乳酸菌制剂添加而逐渐升高，但过高时乳酸菌数量开始降低。乳酸菌制剂组霉菌数量显著低于对照组(<0.001)，且呈一次(<0.001)和二次(=0.005)线性降低，说明霉菌数量随乳酸菌制剂添加逐渐减少，但乳酸菌制剂过高时霉菌开始增加。

表1 乳酸菌制剂对全株玉米青贮微生物数量的影响

2.2 乳酸菌制剂对全株玉米青贮发酵指标的影响

由表2可知，添加乳酸菌制剂对全株玉米青贮的pH无显著影响(>0.05)。乳酸菌制剂组LA较对照组有降低的趋势(=0.067)，且全株玉米青贮的LA含量随着乳酸菌制剂添加量的升高呈一次线性降低(=0.019)，表明乳酸随乳酸菌剂添加逐渐降低；乳酸菌制剂组乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸均显著高于对照组(<0.05)，且乙酸呈一次(=0.011)和二次(<0.001)升高，丙酸呈一次线性升高(=0.036)，总挥发性脂肪酸呈一次(=0.001)和二次(<0.001)升高，说明随着乳酸菌制剂添加量的升高，青贮的乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸逐渐升高，但过高时乙酸和总挥发性脂肪酸开始下降。

表2 乳酸菌制剂对全株玉米青贮发酵指标的影响

2.3 乳酸菌制剂对全株玉米青贮营养成分的影响

各组全株玉米青贮的DM、NDF、ADF和Starch含量均无显著差异(表3，>0.05)。20 mg/kg组CP含量显著高于对照组(=0.042)，且CP随乳酸菌制剂添加量升高呈线性升高(=0.011)，表明提高乳酸菌制剂添加量可提高青贮的CP含量；乳酸菌制剂组NH-N含量显著低于对照组(=0.006)，且呈一次线性降低(=0.002)，说明提高乳酸菌制剂添加量可逐渐降低青贮的氨态氮；10 mg/kg和20 mg/kg组的WSC显著低于对照组(=0.023)，且WSC呈一次线性降低(=0.007)，表明提高乳酸菌制剂添加量可逐渐降低青贮的WSC。

表3 乳酸菌制剂对全株玉米青贮营养成分的影响

2.4 乳酸菌制剂对全株玉米青贮有氧暴露下温度、pH及霉菌的影响

有氧暴露期间，第1～3天，全株玉米青贮的内部温度与室温接近，随后青贮内部温度开始升高(表4)；第4天乳酸菌制剂组青贮的内部温度显著低于对照组(<0.001)，且随乳酸菌制剂添加量的升高呈一次(<0.001)和二次(=0.023)线性降低；第5天青贮的内部温度组间差异不显著(>0.05)，但呈一次(=0.026)线性降低，说明提高乳酸菌制剂添加量可抑制青贮内部温度升高。在第6～7天时各组间无较大差异(>0.05)。

表4 乳酸菌制剂对全株玉米青贮有氧暴露期间温度的影响

由表5可知，与温度变化趋势一致，全株玉米青贮pH在有氧暴露1～3天内变化不大，第4～5天时，pH随乳酸菌制剂添加量的升高呈线性降低(<0.05)，说明提高乳酸菌制剂添加量可有效抑制pH的升高。第5天20 mg/kg组的pH显著低于对照组和2 mg/kg组(=0.005)，在第6～7天时各组间无较大差异(>0.05)。

表5 乳酸菌制剂对全株玉米青贮有氧暴露期间pH的影响

由表6可知，有氧暴露第1～3天内，各组全株玉米青贮的霉菌数量随乳酸菌制剂添加量升高呈一次(<0.001)和二次(<0.05)线性降低，但总的数目变化不大。在第4天后，各组的霉菌数量开始显著升高，且随乳酸菌制剂添加量的升高呈一次线性降低(<0.05)，表明提高乳酸菌制剂添加量可抑制霉菌生长；乳酸菌组的霉菌数量在第4天显著低于对照组(<0.001)，10 mg/kg和20 mg/kg组的霉菌数量在第10天显著低于对照组(=0.004)。

表6 乳酸菌制剂对全株玉米青贮有氧暴露期间霉菌数量的影响

2.5 乳酸菌制剂对全株玉米青贮瘤胃降解率的影响

由表7可知，添加乳酸菌制剂对全株玉米青贮各时间点的DM、CP、NDF和ADF的瘤胃降解率均无显著影响(>0.05)。

表7 乳酸菌制剂对全株玉米青贮瘤胃降解率的影响(DM基础)

3 讨 论

3.1 微生物数量、发酵指标

本研究结果表明，乳酸菌制剂组全株玉米青贮的乳酸菌数量显著升高，霉菌数量显著降低，说明乳酸菌后接种可迅速大量定植，竞争性地抑制霉菌等腐败菌的滋生，这与前人研究结果类似，且乳酸菌制剂添加量在2～10 mg/kg之间时效果较理想。

从发酵指标来看，各组青贮pH无显著差异，有机酸分析发现乳酸含量随乳酸菌制剂添加而降低，乙酸含量先升高后降低，丙酸含量升高。

本研究采用的复合乳酸菌制剂中包含干酪乳杆菌和布氏乳杆菌两种，其中干酪乳杆菌发酵过程中产生乳酸，并降低乙酸产量；而布氏乳杆菌可以将生成的乳酸分解为乙酸和1,2-丙二醇。推测在发酵初期，干酪乳杆菌利用水溶性碳水化合物等发酵生产乳酸，抑制了腐败微生物的滋生。但随着发酵时间的延长，布氏乳杆菌在后期大量繁殖，分解乳酸产生大量的乙酸等挥发性脂肪酸，这也与我们之前的报道相一致。

此外，高剂量乳酸菌制剂组(20 mg/kg)除乳酸降低外，乙酸和总挥发性脂肪酸含量也明显降低，说明接种过量乳酸菌不利于青贮发酵品质的改善。

因此，本研究观测到的pH、乳酸和挥发性脂肪酸含量的变化是干酪乳杆菌和布氏乳杆菌双重作用的结果。

3.2 营养成分

青贮的营养成分含量是评价青贮品质的重要指标，本试验中，各组全株玉米青贮的DM、NDF、ADF和Starch含量均无明显区别。不同类型的乳酸菌对营养成分的影响具有不同的效果，Hu等发现布氏乳杆菌(4×10CFU/g)不影响玉米青贮(发酵240 d)的DM和纤维含量，但植物乳杆菌(1×10CFU/g)可降低其ADF含量。Reich等报道，接种各类型乳酸菌制剂均降低了玉米青贮(发酵215 d)的DM，布氏乳杆菌(4×10CFU/g)和乳酸片球菌(1×10CFU/g)复合接种组的ADF含量降低。王亚芳等研究表明，接种复合乳酸菌制剂(5×10CFU/g)对玉米青贮(发酵45 d)的DM、纤维和Starch均无显著影响。

造成上述研究结果不同的原因可能与各研究采用的乳酸菌发酵类型、添加剂量和青贮发酵时间不同有关。值得注意的是，本试验中乳酸菌制剂组青贮的CP水平升高，NH-N和WSC含量降低，这与前期研究一致。接种乳酸菌制剂后，大量乳酸菌在青贮中定植，利用了的全株玉米的WSC进行厌氧发酵，通过抑制腐败微生物的生长，降低了蛋白质的降解，进而减少了NH-N的产生。

3.3 有氧稳定性

青贮开窖使用后，开始由厌氧环境变为好氧环境，好氧微生物开始活动，易发生霉变、腐败现象，延长青贮的有氧稳定性在生产中具有重要现实意义。

本研究发现，全株玉米青贮暴露4 d后，青贮的内部温度开始急剧升高、pH明显上升、霉菌数量快速增加，说明稳定性被破坏，有氧发酵和霉变现象开始发生。但各组相比较，乳酸菌制剂组在第4天的温度、pH、霉菌数量较不添加组均有不同程度改善，说明添加乳酸菌制剂可以有效延长青贮的有氧稳定性。青贮的有氧稳定性主要与乙酸含量有关，乙酸可以有效抑制真菌的滋生，延缓有氧发酵和霉变现象的发生。

本试验结果表明，乳酸菌制剂组的乙酸含量较对照组分别提高了5.80、4.78、3.27倍，且有氧暴露期间的霉菌数量明显低于对照组，说明高含量的乙酸通过抑制霉菌的生长，增强了有氧稳定性。本研究采用的复合乳酸菌制剂包含干酪乳杆菌和布氏乳杆菌，而乙酸主要由布氏乳杆菌发酵分解乳酸生成，因此青贮有氧稳定性的提高主要与布氏乳杆菌的接种密切相关。

3.4 瘤胃降解特性

为深入评价乳酸菌制剂对全株玉米青贮饲用价值的影响，本试验进一步开展了其瘤胃降解特性的研究。试验结果表明，接种复合乳酸菌制剂并不影响全株玉米青贮各常规营养成分的瘤胃降解率，这与Filya、王亚芳等的研究结果一致，上述研究的乳酸菌接种量分别为1×10CFU/g、5×10CFU/g，接种的乳酸菌包含同型和异型发酵乳酸菌，包括单一接种和复合接种两种形式。但是，Rowghani等报道，接种植物乳杆菌(同型发酵乳酸菌，接种量为6×10CFU/g)可提高玉米青贮的DM降解率。李菲菲等发现，接种同型发酵乳酸菌(植物乳杆菌+戊糖片球菌)的玉米青贮的DM和NDF的瘤胃降解率高于异型发酵乳酸菌(布氏乳杆菌)组，且二者均高于同时接种同型和异型发酵乳酸菌组，各组接种量均为1×10CFU/g。

总的来看，各研究报道中乳酸菌的接种量存在较大差异，且发酵类型也不同，可能是导致瘤胃降解结果不一致的主要原因，而且乳酸菌因为不能有效地利用青贮中的木质素、纤维素、半纤维素等，在改善玉米青贮的瘤胃降解方面的作用有限，这可能是本研究中各组瘤胃降解率无差异的原因。

4 结 论

在本试验条件下，接种复合乳酸菌剂可提高全株玉米青贮的发酵品质和营养价值，抑制有氧暴露后霉菌的滋生从而提高有氧暴露下的稳定性。接种复合乳酸菌剂不影响全株玉米青贮的瘤胃降解特性，复合乳酸菌剂的添加量以2～10 mg/kg为宜。