不同季节猪舍内气溶胶中的细菌多样性分析

程晓亮，陈剑波*，王树华，韩文儒，穆秀梅，淡江华

(1.山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 动物科学学院，山西 太谷 030801)

养殖环境质量是影响养猪生产的重要因素，猪舍内有害气体及悬浮粒子等环境污染物影响猪只生长发育，诱发多种疾病，造成严重经济损失。猪舍内空气中的微生物(细菌、真菌、病毒等)会附着在悬浮粒子上，所形成微生物气溶胶成为猪气源性疾病的主要诱因。研究证实，如非洲猪瘟、猪瘟、猪链球菌病等可通过气溶胶实现短距传播，猪口蹄疫、猪伪狂犬病、猪支原体肺炎等也可经气溶胶长距传播。此外，如果携带人畜共患病病原体的气溶胶向周边居民区扩散，会造成严重的生物安全风险。

微生物气溶胶作为猪舍内气载污染物的重要来源，已引起国内外研究人员广泛关注。研究表明猪舍内微生物气溶胶和猪粪便中的微生物组成有较高相似性。随着舍内环境变化，气溶胶中的微生物会快速适应，产生时间及空间上的动态变化模式。如猪舍类型、饲养模式及季节变化等会导致舍内空气中细菌浓度存在差异。这些研究建立在传统的分离培养方法之上，但其无法全面揭示猪舍内微生物气溶胶的丰富度和多样性。随着高通量测序技术的快速发展及应用，为猪舍空气样本中微生物的多样性检测提供了技术支撑。本研究以山西省某典型规模化猪场为研究对象，分别于不同季节对各类型猪舍内空气样本进行采集，利用高通量测序技术对细菌的群落结构及多样性比较分析，探索气溶胶中的细菌在空间和时间上的分布、变化特征，以期为猪舍内空气质量控制和猪场生物安全防控等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验猪场及饲养管理

选择山西省晋中市介休市某规模化猪场开展研究。该猪场存栏基础母猪480余头，其饲养规模、猪舍结构、通风模式及管理水平在山西省乃至中国北方地区均具有代表性。猪舍采取东西走向，长约25 m，宽约8 m，高约3 m。保育猪舍共28栏，每栏6～8头；育肥猪舍共10栏，每栏14～15头；哺乳母猪舍存栏20头母猪。半封闭式猪舍，舍顶部均匀分布3个通风口，自然采光及通风，冬季地暖保温。猪只自由饮水，早晚人工清粪。

1.2 样品采集与处理

分别于夏季(采样时舍外温度为27.3～34.0 ℃)、秋季(采样时舍外温度为18.3～18.7 ℃)、冬季(采样时舍外温度为-5.4～-1.5 ℃)进行猪舍内气溶胶的采集和处理。BX、BQ、BD分别代表保育猪舍的夏季、秋季、冬季空气样本，FX、FQ、FD分别代表育肥猪舍的夏季、秋季、冬季空气样本，MX、MQ、MD分别代表哺乳母猪舍的夏季、秋季、冬季空气样本。选用六级空气微生物采样器采集猪舍空气样本(JWL-S6型，北京先能技术开发有限责任公司，空气流速率为28.3 L·min，采集时间为3 min)，选用玻纤膜(天津市领航实验设备有限公司)为采样介质，采样点为猪舍中间过道的中点位置，距地面高度为1.2 m(猪背高处)，每个采样点设3个重复，采样前后均需对采样器进行消毒。玻纤膜空气样本采集后放入无菌冻存管中，并迅速投入液氮，带回实验室，于-80 ℃冰箱保存。

1.3 DNA提取与测序

将剪碎的玻纤膜空气样本放入裂解液中充分裂解，待样本裂解完毕后，采用德国MN公司的NucleoSpin 96 Soil (4×96)试剂盒进行细菌基因组DNA的提取，并用DNA 浓度检测仪器测定基因组DNA的浓度，将符合测样要求的细菌基因组DNA样本送百迈克生物科技有限公司开展高通量测序。

以送检DNA样本作为PCR反应模板，以338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'作为引物，扩增细菌基因组16S rRNA的v3～v4区域。将PCR产物纯化、定量与均一化处理，形成测序文库。选用Illumina HiSeq 2500平台对质检合格文库测序。

1.4 数据处理

优化测序结果，将优化序列(Tags)聚类，划分OTUs(Operational taxonomic units)，揭示猪舍空气样本的细菌群落结构；分别采用Mothur(version v.1.30)软件和QIIME软件对送检样本进行α多样性(Alpha diversity)、β多样性(Beta diversity)分析，比较不同季节及各类型猪舍内气溶胶中细菌多样性方面存在的差异。此外，使用SPSS 24.0进行检验。当<0.05时，表示在95%的置信区间内具有统计学上的显著差异。

2 结果与分析

2.1 测序数据统计

选用Illumina Miseq高通量测序技术，分别测得不同季节、各类型猪舍内空气样本的序列数据。其中，共产生优化序列1 524 972条，每个样本至少产生43 145条优化序列。以序列相似度97%为标准，将优化序列划分为OTUs，共产生OUTs为1 547个，不同样本OTUs范围为315～1 159个。

2.2 猪舍空气中细菌α多样性分析

对猪舍内空气样本开展α多样性指数分析，结果见表1，不同季节、各类型猪舍内的空气样本均获得99%以上的高覆盖度，反映测序结果的全面性。在图1中，随着样品序列数量的增加，Shannon指数稀释曲线逐渐趋于平坦，OTUs不再随着测序数量增加而增长。说明测序数量能够代表空气样本中的大多数细菌信息，反映测序结果的真实性。

图1 样本Shannon指数稀释曲线

由表1可以看出：各类型猪舍空气中细菌的丰富度(Chao1指数、ACE指数)和多样性(Shannon指数、Simpson指数)均表现出明显的季节性变化趋势，冬季>秋季>夏季。其中，育肥猪舍秋、冬两季更替时菌群丰富度和多样性指数变化显著，冬季Chao1、ACE指数极显著大于夏秋季(<0.01)，Shannon指数显著大于夏秋季，Simpson指数显著小于夏秋季(<0.05)；哺乳母猪舍夏、秋两季更替时菌群丰富度和多样性指数变化显著，秋季Chao1、ACE、Shannon指数极显著大于夏季，Simpson指数极显著小于夏季(<0.01)。此外，由表2可见，秋季育肥猪舍菌群丰富度和多样性指数均极显著小于哺乳母猪舍(<0.01)；夏季保育猪舍菌群丰富度和多样性指数略大于育肥猪舍、哺乳母猪舍，但差异不显著(>0.05)。

表1 不同季节猪舍空气样本Alpha多样性指数统计

表2 不同类型猪舍空气样本Alpha多样性指数统计

2.3 猪舍空气中细菌群落结构差异分析

为进一步研究猪舍类型、季节变化对猪舍空气中细菌气溶胶群落结构的影响，利用非度量多维尺度分析法(NMDS)对不同样本的菌群结构差异进行分析(图2)。在所有猪舍空气样本中，冬季各样本间距离较近，且单独聚为一簇，而夏、秋季的样本相互重叠。这说明冬季各类型猪舍间空气样本菌群结构差异较小，且冬季样本菌群特征明显区分于其他季节。NMDS 分析的 stress 值为0.028，表明排序结果可信。

图2 样本NMDS分析图

2.4 猪舍空气中细菌群落结构组成分析

在不同季节，各类型猪舍空气样本中共获得细菌分为23个门，547个属。

从表3可以看出：在门水平下，猪舍空气中细菌主要由变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)等组成。优势菌门的相对丰度值均表现出季节性差异，秋、冬季节更替时变化明显，夏、秋季节更替时则差异均不显著(>0.05)。在保育猪舍，冬季变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度值均显著大于夏、秋季(<0.05)；芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)相对丰度值极显著大于夏、秋季(<0.01)；厚壁菌门(Firmicutes) 相对丰度值显著小于秋季(<0.05)，极显著小于夏季(<0.01)。在育肥猪舍，冬季变形菌门(roteobacteria)相对丰度值显著大于夏季(<0.05)；酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度值显著大于夏、秋季(<0.05)；芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)相对丰度值显著大于秋季(<0.05)，极显著大于夏季(<0.01)；厚壁菌门(Firmicutes) 相对丰度值显著小于夏、秋季(<0.05)；在哺乳母猪舍，冬季变形菌门(roteobacteria)显著大于夏季(<0.05)；酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)相对丰度值均极显著大于夏、秋季(<0.01)；芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)相对丰度值显著大于秋季(<0.05)，极显著大于夏季(<0.01)；厚壁菌门(Firmicutes) 相对丰度值显著小于夏、秋季(<0.05)。此外，从猪舍类型分析(表4)，各类型猪舍间细菌群落结构相似度较高。在秋季，保育猪舍蓝藻细菌门(Cyanobacteria)相对丰度值显著小于哺乳母猪舍(<0.05)，其他优势菌门的相对丰度值均差异不显著(>0.05)。

表3 不同季节猪舍空气样本门水平上的优势菌群占比

表4 不同类型猪舍空气样本门水平上的优势菌群占比

从属分类水平挑选丰富度最高的前20个菌群作物种丰富热图。从图3可以看出：猪舍空气中细菌群落结构表现出明显的季节性差异。在夏、秋季，___、乳酸杆菌属()、葡萄球菌属()为优势菌属。在冬季，鞘脂单胞菌属()、____6、___为优势菌属。此外，从猪舍类型分析，各类型猪舍间细菌群落结构相似度较高。

图3 属水平上的物种丰度热图

将猪舍空气中细菌相对丰度较高(在属分类水平丰富度最高的前50个物种，且相对丰度值大于0.1%)的潜在动物病原菌属进行整理，结果见表5。从表5可以看出：病原菌属相对丰度值均表现出明显的季节性差异，夏、秋季高于冬季。其中，在保育猪舍，夏季埃希氏-志贺菌属(-)、不动杆菌属()相对丰度值显著大于冬季(<0.05)，秋季棒状杆菌属(_1)、链球菌属()相对丰度值显著大于冬季(<0.05)；在育肥猪舍，夏季链球菌属()、不动杆菌属()相对丰度值显著大于冬季(<0.05)；在哺乳母猪舍，夏季埃希氏-志贺菌属(-)、链球菌属()、葡萄球菌属()、棒状杆菌属(_1)相对丰度值显著大于冬季(<0.05)，秋季埃希氏-志贺菌属(-)、不动杆菌属()、假单胞菌属()、梭状芽孢杆菌属(___1)相对丰度值显著大于冬季(<0.05)。此外，从猪舍类型分析(见表6)，在夏季，各类型猪舍间葡萄球菌属()相对丰度值均维持较高的水平，彼此差异不显著(>0.05)；在夏季，育肥猪舍埃希氏-志贺菌属(-)相对丰度值高于保育猪舍和哺乳母猪舍，但差异不显著(>0.05)。

表5 不同季节猪舍空气样本优势菌属中潜在病原菌分布情况

表6 不同类型猪舍空气样本优势菌属中潜在病原菌分布情况

3 讨 论

3.1 猪舍空气中细菌多样性分析

国内前期关于猪舍内微生物气溶胶丰度变化规律的研究多基于传统培养法。有研究表明猪舍类型、季节变化对气溶胶中可培养的总需氧菌及致病菌数量有明显影响。本人前期研究表明，保育猪舍总需氧菌浓度季节性变化趋势为冬季显著高于其他季节，夏季在部分时间点高于春、秋季。与传统培养法相比，高通量测序技术在分析微生物气溶胶的多样性及丰度方面有着天然的优势。本研究利用高通量测序技术获得猪舍空气样本总OTU数为1 547，不同样本OTU数范围为315～1 159。从季节变化上分析，猪舍空气中细菌丰富度和多样性指数表现出明显的季节性差异，冬季>秋季>夏季。有研究表明分娩猪舍内小气候变化特别是舍内风速等环境因素对细菌气溶胶的丰富度和多样性有一定的影响。本研究试验猪场位于山西省中部盆地，为典型大陆季风气候，四季分明，秋冬季早晚温差大。各类型猪舍均采取自然通风模式。在夏季，猪舍通过开窗通风实现降温；进入秋季，天气转凉，哺乳母猪舍通风次数明显减少，舍内空气中细菌丰富度及多样性指数显著升高；进入冬季，育肥猪舍也采取密闭保温模式，其丰富度和多样性指数也显著升高。此外，从猪舍类型上分析，在夏、秋季，各类型猪舍间菌群丰富度和多样性均存在明显差异。有研究结果表明，除了通风因素外，舍内其他环境因素的变化也会影响细菌的多样性，即在相对封闭条件下，猪群饲养密度、舍内环境卫生等可能是影响猪舍空气中细菌丰富度及多样性的重要因素。

3.2 猪舍空气中优势菌群分析

通过细菌群落结构分析，在不同季节，各类型猪舍空气样本中共获得23个门，547个属。在门水平下，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)等为猪舍微生物气溶胶样本中的优势菌门。这与国内相关报道较为一致。在属水平下，猪舍空气中的优势菌属种类及相对丰度存在季节性差异，夏、秋季优势菌属为___、乳酸杆菌属()、葡萄球菌属()等、冬季优势菌属为鞘脂单胞菌属()、____6、___等。张喜庆在猪舍内气溶胶样本中发现梭状芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、尤微菌属为主要优势菌属，同本研究结果存在差异，这可能与不同地区地理、气候环境或试验猪场在饲养方式、营养配方上存在的差异相关。此外，不同类型猪舍内环境存在差异，导致猪舍内菌群结构不同，本研究也发现，各类型猪舍间空气中优势菌属的相对丰度值存在差异，但大部分差异不显著。

在丰度水平前50的细菌群落中发现文献中已报道的病原菌，包括不动杆菌属()、梭状芽孢杆菌属(___1)、棒状杆菌属(_1)、埃希氏-志贺菌属(-)、假单胞菌属()、葡萄球菌属()、链球菌属()等。病原菌不仅对畜禽以及养殖场工作人员的健康产生影响，也给养殖场的生物安全防控带来巨大挑战。其中，链球菌通过粘膜感染引起的败血症、脑膜炎、关节炎甚至急性死亡，同时继发多种呼吸道炎症，是一种重要的人畜共患病病原。梭状芽孢杆菌属中的产气荚膜梭菌和埃希氏-志贺菌属中的大肠杆菌是引起仔猪细菌性腹泻的常见病原体。葡萄球菌作为一种条件致病菌广泛存在于畜禽舍空气内、动物体表，可诱发仔猪渗出性皮炎、呼吸道感染、脑膜炎、败血症等多种疾病。本研究发现猪舍空气样本中优势病原菌属相对丰度值的季节性变化趋势较一致，表现为夏、秋季明显高于冬季，这与样本的菌群丰富度及多样性变化趋势相反。虽然秋、冬季交替后病原菌属的相对含量明显下降，但考虑到冬季冷热应激以及有害气体、粉尘浓度升高等因素造成的不利影响，猪群相对易感，此时仍需加强微生物气溶胶特别是病原菌的有效控制，切断疾病的传播渠道，降低猪场生物安全风险。

4 结 论

猪舍空气中细菌丰富度和多样性表现出季节性变化趋势，冬季>秋季>夏季；在夏、秋季，猪舍类型也是影响细菌多样性的重要因素。猪舍空气中细菌群落结构表现为季节性差异，秋、冬季节更替时变化明显，各类型猪舍间细菌群落结构相似度较高。在猪舍空气样本的优势菌属中发现大量潜在动物病原菌，并具有较明显的季节性变化特征，猪场应加强相应的生物安全措施。