粪源抗生素抗性基因在土壤中的沉积效果研究进展

徐焘杰，简宗辉，孙 帅，闫世雄，黄 英，赵素梅，贾俊静

(云南农业大学 动物科学技术学院/云南省动物营养与饲料科学重点实验室，云南 昆明 650201)

抗生素通过多种方式抑制或杀灭病原菌，曾在动物生产中被广泛使用。抗生素的给药途径包括口服给药、舌下给药、直肠给药等多种途径，由于方便且制剂便宜，口服成为抗生素首选给药途径。口服方式使肠道细菌直接暴露于抗生素，通过自然选择作用引起耐药细菌的不断出现，以及家畜胃肠道中抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)的不断积累。

2006年，ARGs首次被列为一类环境新兴污染物，对生态环境构成了严重的破坏。在家畜体内，携带ARGs的抗性细菌以及细胞外游离ARGs可随粪便排出体外，使得动物粪便成为ARGs的重要储存库。土壤作为地球上最大和最多样化的微生物栖息地之一，为ARGs的长久寄居和不断传播创造了有利条件，长期施用家畜粪便的土壤中ARGs的丰度和多样性会显著增加。而土壤中ARGs的不断沉积，会导致土壤微生物耐药谱的增加和耐药性的增强。

本文就家畜粪便来源的ARGs在土壤中的沉积效果进行了系统总结，以揭示ARGs对环境和人类健康的潜在影响，期望为ARGs传播的早期预警和控制工作提供参考和指导。

1 ARGs的特性与类型

1.1 ARGs的特性

ARGs广泛分布于土壤和水生环境中，与传统的化学和物理污染物有所不同，作为一种基因污染物，ARGs具有可复制性、传播性、环境持久性等特点。即使耐药菌死亡，ARGs 也可以DNA的形式在环境和人体中发生定植和转移，造成ARGs在环境治理过程中难以控制和消除。不同种类的ARGs之间存在共选择作用，从而增强微生物的多重耐药性，其原因可能是因为不同种类ARGs存在于同一个质粒或者转座子上会同步复制和转移，也可能是因为微生物获得了一种ARGs之后，对其它ARGs的通透性加强。

1.2 ARGs的类型和种类

依据来源、耐药机制和耐药性可分别对ARGs进行类型划分。根据ARGs的来源可分为天然抗性基因和获得性抗性基因，天然抗性基因在抗生素使用之前就存在，是位于染色体上可以遗传的基因，如链球菌对庆大霉素的耐药性就是天然抗性基因引起的；获得性抗性基因是微生物接触抗生素后，由于遗传基因的变化、生存代谢途径的改变等而产生的耐药基因。此外，水平基因转移(Horizontal gene transfer，HGT)是获得性抗性基因形成的主要途径，其主要依赖于质粒、转座子和整合子等可移动遗传元件(Mobile genetic elements，MGEs)的作用。根据ARGs的耐药机制进行分类，可分为抗生素失活、外排泵、细胞保护和未知机制等4类ARGs。根据耐药性进行分类最常见，包括多重耐药类、磺胺类、氨基糖苷类等抗性基因。同一类型的ARGs还可分为多个种类，不同种类的ARGs可能具有不同的耐药机制，如四环素类抗性基因涵盖了所有4种耐药机制，即外排泵(、和等)、细胞保护(、和等)、抗生素失活()和未知机制(、和等)。

2 家畜粪便中的ARGs分布状况

2.1 鸡粪中ARGs的分布

鸡的养殖密度大且销售期短，抗生素的使用剂量较高，又因为鸡的消化功能差，造成鸡粪中ARGs污染程度较大。钱勋在鸡粪中检出多达134种ARGs，种类和总相对丰度均大于猪粪和牛粪，且不同养殖场采集的鸡粪中的ARGs组成相似。磺胺类抗性基因在鸡粪中具有较高水平，武晋萍等的研究结果表明鸡粪与中药渣共堆肥样品检测到的相对丰度增加。除了磺胺类抗性基因，四环素类抗性基因在鸡粪中也存在较严重的污染。Cheng等调查了中国东部杭州市中小型鸡场的鸡粪中四环素类和磺胺类抗性基因的丰度和多样性，结果显示中型鸡场鸡粪中各种ARGs的相对丰度高于小型鸡场，且两种规模的鸡场中的相对丰度均最高，其次是和。尽管自1994年起，由于氯霉素具有不良副作用，欧洲联盟(EU)已禁止在食用动物中使用氯霉素，但氯霉素在鸡粪中仍然存在较高的污染水平。

2.2 猪粪中ARGs的分布

猪肉是人均消费最多的畜禽肉类，猪粪中检出的ARGs的丰度和多样性仅次于鸡粪。许多研究表明，猪粪中磺胺类抗性基因的污染程度较高。Duan等在猪粪和猪粪堆肥样品中检测到磺胺类抗性基因(和)总绝对丰度高于四环素类(和)和大环内酯类抗性基因(、、、和)，磺胺类抗性基因中的丰度大于。四环素类抗生素是养猪业常用的治疗疾病和促进生长的抗生素，因此四环素类抗性基因在猪粪中普遍存在，其中核糖体保护蛋白基因在猪粪中占主导地位。Cheng等的研究结果表明，猪粪中核糖体保护蛋白基因(、和)丰度高于外排泵蛋白基因(、、、和)，钝化酶基因()的丰度介于外排泵蛋白基因和之间。此外，研究还发现，猪的发育阶段不同，猪粪中ARGs丰度也不一致。

2.3 牛粪中ARGs的分布

与猪场和牛场相比，牛场的饲养密度低，出栏时间长，因此牛场中抗生素使用量更低，从而使牛粪中ARGs的丰度和多样性相对较低。Qian等分析了不同畜禽粪便中ARGs的相对丰度，结果显示牛粪ARGs的种类和总丰度低于鸡场和猪场，其中β-内酰胺类抗性基因的污染程度最高。除了β-内酰胺类抗性基因，牛粪中磺胺类抗性基因污染程度较高。Ji等的研究结果表明,牛粪中所有磺胺类抗性基因相对丰度均高于四环素类抗性基因，磺胺类抗性基因相对丰度大小顺序为。奶牛是耐药细菌的储存库，并且所有年龄段的奶牛都会释放这些微生物。Haley等对断奶前犊牛和泌乳奶牛的粪便的宏基因组进行了测序和分析，结果发现所有样品中检出频率最高的是四环素和氨基糖苷类抗性基因，且四环素类抗性基因的相对丰度最高，其中大于其它ARGs。另外，断奶前犊牛的粪便ARGs丰度显著高于泌乳奶牛，其原因可能是幼年奶牛倾向于接受更多的抗生素治疗。

3 家畜粪便污染的土壤中ARGs分布状况

3.1 鸡粪污染的土壤中ARGs的分布

农田土壤施鸡粪有机肥能有效提高土壤肥力，但施肥持续时间并不是污染程度的决定性因素。Zhou等发现施用鸡粪商业有机肥可显著增加土壤中的ARGs的相对丰度，但每次施用两个月后相对丰度降低，且ARGs的相对丰度在首次施用和重复施用之间没有显著差异。相似地，Chen等也发现长期施用鸡粪可显著增加土壤中ARGs的丰度和多样性，其中β-内酰胺类、四环素类和多重耐药类抗性基因占主导地位。磺胺类药物在鸡粪污染的土壤中常被检测到，并往往存在较严重的污染。Zhao等利用qPCR技术分析了长期施用鸡粪的农田土壤ARGs的污染程度，结果表明土壤中磺胺类抗性基因(和)的相对丰度均高于四环素类抗性基因(、和)，磺胺类抗性基因中的相对丰度高于。

3.2 猪粪污染的土壤中ARGs的分布

由于猪粪中具有丰富的ARGs，因此猪粪浇灌的农田土壤，猪场周围土壤，以及猪场下游污水渗入土壤均存在ARGs的污染。与鸡粪污染的土壤相似，猪粪污染的土壤会使ARGs的丰度增加，但添加猪粪之后ARGs的丰度会逐渐降低。磺胺类抗性基因在猪粪污染的土壤中具有较高的多样性和丰度，Zhang等对施用了猪粪发酵沼液的葡萄地土壤中ARGs的分布状况进行了分析，结果检出了4种磺胺类抗性基因(、、和)，相对丰度最高的是，其次是。对于喹诺酮类抗性基因，和的污染程度较高，而其它喹诺酮列抗性基因的污染程度则较低。四环素类抗性基因在猪粪污染的土壤中具有丰富的多样性，Wu等研究表明，外排泵蛋白基因(、、和)在猪粪污染土壤中检出频率较高。此外，由于氯霉素便宜、广谱、易于储存，仍被一些小农场主非法使用，导致猪粪污染的土壤中仍存在较高水平的氯霉素类抗性基因。

3.3 牛粪污染的土壤中ARGs的分布

由于牛粪ARGs丰度和多样性较低，因此对土壤的造成污染程度也相对较低。程建华等分析了不同类型畜禽养殖场土壤中ARGs的丰度和多样性，结果在牛场土壤样品中检测到27种ARGs，种类低于鸡场土壤(44种)和猪场土壤(36种)，且其中只有10种仅在牛场土壤存在。牛粪污染的土壤中磺胺类抗性基因和部分喹诺酮类抗性基因的污染程度较高。Mu等通过qPCR检测了牛场土壤中四环素类(、、和)、磺胺类(和)、喹诺酮类(和)和大环内酯类抗性基因(和)的绝对丰度，结果表明、和的绝对丰度较高，而其它的ARGs绝对丰度较低，三者绝对丰度高低顺序为。

3.4 未受畜禽粪便污染的土壤中ARGs的分布

土壤微生物区系代表了抗生素抗性的一个古老的进化起源，土壤一直被认为是ARGs的丰富储存库，这些ARGs有的来自于自然过程，而与人类活动无关。土壤中的这种抗生素抗性称为内在抗性(Intrinsic resistance)，导致未受畜禽粪便污染土壤中也能检测出ARGs，尽管其中ARGs的丰度和多样性比较低。Su等在未施粪肥和堆肥的水稻土样品WG的宏基因文库中筛选到1个利福平耐药克隆、1个氯霉素耐药克隆和1个氨基糖苷类耐药克隆，在未施粪肥和堆肥的水稻土样品QG的宏基因文库中也筛选到1个氨基糖苷类耐药克隆和1个四环类耐药克隆。Wang等在没有使用过粪肥和抗生素的森林土壤中检测到了丰度较低的磺胺类抗性基因(、和)，且从中分离的磺胺类药物抗性(Sulfonamide-resistant，SR)细菌经过PCR定性鉴定后未检测到。

4 粪源ARGs在土壤中的沉积效果

4.1 粪源ARGs在土壤不同层次中的沉积效果

粪源ARGs在土壤中具有一定的垂直分布特点，在土壤不同层次结构中表现不同的沉积效果。Tang等在不同深度的水稻土均检测到四环素类抗性基因，且四环素类抗性基因的丰度随着土壤深度的增加而降低。不同的是，Peng等的研究结果表明在猪粪和猪粪堆肥施肥的土壤中，各种四环素类抗性基因的相对丰度随土壤深度的增加而增加，但随着土壤深度的进一步增加部分四环素类抗性基因的相对丰度降低。这些现象说明，在一定的范围内，ARGs的沉积效果与土壤深度呈正相关，而超过这个范围后，ARGs的沉积效果与土壤深度呈负相关。此外，一些研究还表明，不同ARGs的沉积效果差异性在不同土壤层次也表现不同。刘博等研究了入渗区土壤中四环素类抗性基因的存在丰度，结果发现底泥土壤(采样深度10 cm)中各种四环素类抗性基因绝对丰度高于包气带土壤(采样深度30 cm)。游离态四环素抗性基因吸附试验结果表明，包气带土壤对携带、、和质粒的吸附效果十分接近，而底泥对携带和目的片段的质粒的吸附效果高于携带和目的片段的质粒。

4.2 不同类别粪源ARGs在土壤中的沉积效果

ARGs种类也是影响粪源ARGs在土壤中的沉积效果的重要因素。施用有机肥有助于土壤中ARGs的积累，主要包括磺胺类抗性基因。磺胺类抗性基因宿主菌十分广泛，且容易利用可移动遗传元件进行转移，因此具备很强的环境沉积潜力。He等调查了室内养殖和自由放养的肉鸡场鸡粪和周边环境ARGs的污染状况和传播特点，结果显示在各类ARGs中，磺胺类抗性基因(和)具有最高的土壤沉积效果，其中开平市的6个自由放养鸡场土壤的平均相对丰度是相应鸡场鸡粪的2倍多。Wang等检测了中国东南部养殖场畜禽粪便和土壤等环境中四环素类、磺胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类5类抗生素抗性基因的丰度，结果显示磺胺类抗性基因的传播性最强，其次是四环素类和大环内酯类抗性基因。除了磺胺类抗性基因，多重耐药类抗性基因在畜禽粪便污染的土壤中具有较高的丰度，同样具有较高的沉积效果。Fang等的研究结果显示鸡粪施肥温室土壤中多重耐药类抗性基因的相对丰度最高，且与鸡粪相比，温室土壤中多重耐药类抗性基因的相对丰度更高，而其它类ARGs的相对丰度更低。

4.3 不同种类粪源ARGs在土壤中的沉积效果

ARGs的类别相同但种类不同，也会表现出不同的沉积效果。对于磺胺类抗性基因，的沉积效果一般大于，因为污染水平更易受到人为活动因素的干扰。对于四环素类抗性基因，许多研究表明，畜禽粪便与受污染土壤中核糖体保护蛋白基因的丰度均高于外排泵蛋白基因，表明核糖体保护蛋白可以赋予细菌强大的四环素抗性。经常与可移动遗传元件相关联，从而增强了从一种细菌向另一种细菌的转移能力，所以具有最广泛的宿主范围，在土壤具有较理想的沉积效果。β-内酰胺类抗性基因的沉积效果同样表现出种间差异性。谷艳茹等调查了家庭农场不同畜禽养殖粪污及其周边土壤中ARGs的相对丰度，在5种-内酰胺类抗性基因(、、、和)中，和在猪场和鸡场周边的土壤中沉积效果最佳，而在牛场周边土壤中沉积效果最佳。

5 影响粪源ARGs在土壤中的沉积效果的环境因子

5.1 粪便中抗生素对ARGs沉积效果的影响

大多数兽用抗生素很难被动物吸收，因而容易随粪便排出进入土壤。残留的抗生素可能会对环境微生物施加选择压力，导致抗生素抗性微生物及其携带的抗性基因的传播。Xiong等的研究结果表明，猪粪中添加氟喹诺酮可后土壤中4种质粒介导的喹诺酮类抗性基因(、、(6')Ⅰ-和)的相对丰度显著提高了。相似地，Zhao等研究发现在长期施用鸡粪的农田土壤样品中观察到磺胺类抗性基因与磺胺类药物浓度之间存在显著的相关性，表明磺胺类药物可诱导ARGs的出现，并对土壤环境造成污染。常旭卉等对培养81 d的土样进行了定量分析，与添加了不含环丙沙星鸭粪的土壤相比，添加了含有环丙沙星鸭粪的土壤的和的绝对丰度显著提高，而的绝对丰度反而显著降低了，其原因可能是携带的土壤细菌在抗生素的作用下减少了。

5.2 粪便中重金属对ARGs沉积效果的影响

除抗生素外，重金属如Cu和Zn也是一种重要的饲料添加剂，对动物健康生长具有重要作用。当重金属添加过量时，也会被排泄并散布到土壤等环境中，形成重金属污染。重金属的存在为抗生素抗性提供了另一种共选择压力，从而促进土壤中ARGs的形成和传播。Lin等检测了施重金属粪肥的土壤中的重金属含量及ARGs的丰度，结果显示重金属粪肥使用量越高，土壤中重金属丰度和ARGs丰度越高，从而表明畜禽粪便中重金属可促进土壤中ARGs的沉积。张毓森等研究了分别施加猪粪和CuCl对土壤中的ARGs丰度的影响，结果发现猪粪和CuCl均能显著提高土壤中Cu、Zn、P和ARGs的含量，说明猪粪的施加向土壤中引入了重金属Cu、Zn和矿质元素P，重金属可能促进了土壤中ARGs增殖扩散，另一方面本研究也反应了矿质元素也可能是影响粪源ARGs在土壤中的沉积的环境因子。

6 结语与展望

家畜粪便可通过各种途径进入其他环境和食物链，最终威胁人类健康。据估计，到2050年，每年因抗生素耐药性而死亡的人数将超过1 000×10人，在全世界造成约100×10美元的损失。粪源ARGs在土壤中的沉积具有一定的垂直分布规律，并且不同类别或种类的ARGs在土壤中沉积效果存在差异。虽然违禁药物如万古霉素类和氯霉素早已被严禁用于动物生产中，在未来的工作中，仍不能忽视对其抗性基因在土壤中污染状况的监控。