双水相超声法提取野蘑菇三萜类化合物的工艺优化

王浩豪，王术荣 (.晋城市综合检验检测中心，山西晋城 048000；.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 03080)

野蘑菇(Schaeff ex Fr.)，又名田蘑菇，属担子菌纲(Basidiomycetes)伞菌目(Agaricales)蘑菇科(Agaricaceae)蘑菇属()，多分布于黑龙江、内蒙古、新疆、青海、山西、西藏等地。野蘑菇的子实体中到大型，食用起来口感细嫩、味道鲜美，营养价值高。野蘑菇也可药用，有驱除风寒、舒经活络的奇效，是清代名药“舒筋散”中的主要成分。近年来，相关研究发现野蘑菇有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、预防三高、保肝护肝及优化血管神经系统等作用。这与其中的三萜类化合物、多糖、多肽、多酚类等生物活性成分密切相关。

三萜类化合物(triterpenoids)大多是由30个碳原子组成的萜类化合物，少量含有27个碳原子。三萜类化合物又叫灵芝酸，广泛存在于自然界中，有的以游离的形式存在，有的则与糖结合以苷的形式存在，又称三萜皂苷(triterpenoid saponins)。游离的三萜可溶于有机溶剂，难溶于水。目前已从香菇、桦褐孔菌()、紫芝()、灵 芝()、茯苓()、桦褐孔菌()、粗毛纤孔菌()、红缘拟层孔菌()等多种真菌中分离出三萜类物质。三萜类化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等生物活性。目前常用的提取三萜类化合物的方法有回流浸提法、超声波提取法、超临界流体萃取法和微波提取法等。回流浸提法根据原料中各种成分在溶剂中的溶解程度不同进行回流提取处理，提取程度剧烈，耗时稍长。超临界流体萃取得率较高，但成本也高，微波提取则难以规模化应用。超声波提取技术短时节能，在细胞破碎、药用成分的分离抽提等方面有广泛应用。双水相萃取技术则是通过不同成分在上下两相溶剂中的选择性分布来达到分离的目的，该方法可操作性强，可以最大程度地保持提取物质的活性，在细胞、分子生物等研究领域应用广泛。笔者建立了一种双水相超声波提取并用UV法快速检测野蘑菇菌丝体中三萜类化合物含量的简便方法，并通过单因素试验及Box-Behnken试验设计对提取条件进行了优化，旨在为野蘑菇的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

供试野蘑菇菌种(编号：817)由山西农业大学食品科学与工程学院食用菌实验室提供。白桦脂醇标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他试剂未特殊说明均为国产分析纯。

提取方法。将4 ℃保藏的野蘑菇菌种于25 ℃活化一段时间后，接种于PDA试管斜面培养基上。在25 ℃下培养10 d直至培养基上长满菌丝。再将菌种接种并扩大培养在液体培养基中，放入25 ℃恒温摇床中以120 r/min的速率培养11 d即得到野蘑菇菌丝体。取出菌丝体清洗过滤，置于55 ℃烘箱中干燥。烘干后的菌丝体于微型粉碎机中粉碎成粉末，备用。

取上述菌丝体粉末100 mg，加入5 mL双水相溶剂浸提2 h，超声一定时间，离心15 min，取上清液，即为三萜粗提液。

测定方法。

标准曲线的制作 。称取 2.0 mg白桦脂醇标准品，用少量无水乙醇充分溶解，再加乙醇定容至50 mL，得到质量浓度为40 μg/mL的白桦脂醇标准品母液。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的白桦脂醇标准品母液于2 mL离心管中，100 ℃沸水加热蒸干乙醇，依次加入0.2 mL 5%香兰素-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分摇晃，60 ℃金属浴中保温20 min后立即放入冰水中降至室温，随后再加入乙酸乙酯定容至5 mL，充分摇晃，静置5～10 min，得到不同浓度的白桦脂醇标准品溶液。

以空白溶液(不加样品加检测试剂的空白检测液)为参比，将白桦脂醇标准品溶液分别在紫外分光光度计中550 nm处测定吸光值。平行试验3次。以白桦脂醇的质量为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。

三萜含量的测定。取三萜粗提液用30%乙醇定容，100 ℃水浴蒸发干粗提液中的有机溶剂，依次加入0.2 mL 5%香兰素-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分摇晃均匀，在60 ℃金属浴中保温20 min后，放入冰水中降至室温。再加乙酸乙酯定容至5 mL，充分摇晃，静置5～10 min后，4 800 r/min 4 ℃离心10 min，以空白溶液作为参比，在550 nm波长处测定溶液吸光度。按照白桦脂醇质量与吸光值关系公式计算三萜含量，并计算三萜提取率：

三萜提取率(%)=××100

式中：为提取液中三萜的质量浓度，mg/mL；为提取液的定容体积，mL；为菌丝体粉末的克数，mg。

单因素试验。

异丙醇体积浓度的确定。分别称取100 mg菌丝体粉末样品于离心管中，加入5 mL异丙醇(体积分数分别为25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%)-硫酸铵(质量浓度为0.225 g/mL)双水相溶剂中浸泡2 h，超声(320 W 4 ℃)提取15 min，4 800 r/min离心10 min。取上清液用30%乙醇定容，通过紫外分光光度法测定三萜含量并计算提取率，以确定最佳异丙醇体积浓度。

硫酸铵质量浓度的确定。分别称取100 mg菌丝体粉末样品于离心管中，加入5 mL异丙醇(体积分数为40%)-硫酸铵(质量浓度分别为 0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300 g/mL)双水相溶剂中浸泡2 h，超声(320 W 4 ℃)提取 15 min，4 800 r/min离心10 min。取上清液用30%乙醇定容，测定三萜含量并计算提取率，以确定最佳硫酸铵质量浓度。

超声时间的确定。分别称取100 mg菌丝体粉末样品于离心管中，加入5 mL 40%异丙醇-0.225 g/mL硫酸铵双水相溶剂中浸泡2 h，分别超声(320 W 4 ℃)提取 10、15、20、25、30、35、40 min，4 800 r/min离心10 min，取上清液用乙醇定容，测定三萜含量并计算提取率，以确定最佳超声时间。

提取工艺优化。通过上述单因素试验，选取异丙醇体积浓度、硫酸铵质量浓度和超声时间3个因素3个适宜水平设计响应面试验，利用Minitab软件程序进行试验数据分析，从而对三萜提取工艺进行优化。

2 结果与分析

以白桦脂醇的质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，制作标准曲线(图1)。回归方程为=0008 6-0011 9，式中，为白桦脂醇质量(μg)，为吸光值。该标准曲线线性关系良好，适用于后续试验野蘑菇菌丝体中三萜含量的测定。

图1 白桦脂醇吸光值标准曲线Fig.1 Absorbance standard curve of betulin

异丙醇体积浓度的确定。从图2可以看出，异丙醇体积分数与三萜类化合物提取率的数据关系中存在一个峰值，当异丙醇浓度在40%时，三萜提取率最高，为2.1%。由相似相溶原理可知，双水相体系中上相40%异丙醇的极性作用与野蘑菇中三萜的极性电性相似，因此三萜提取率较高，可作为进一步优化三萜提取率的体积分数。

图2 异丙醇体积浓度对野蘑菇三萜提取率的影响Fig.2 Effect of isopropyl alcohol concentration on extraction rate of triterpenoids

硫酸铵浓度的确定。从图3可知，选择40%异丙醇作为有机相，硫酸铵质量浓度为0.100～0.225 g/mL时，三萜的提取率随硫酸铵浓度的升高而增大。当硫酸铵质量浓度为0.225 g/mL时，三萜提取率最高；随着硫酸铵的质量浓度继续增大，三萜的提取率又出现一个小的波动，说明上相异丙醇的极性受到非极性盐硫酸铵浓度的影响，从而改变了三萜类化合物在其中的含量分配。

图3 硫酸铵质量浓度对野蘑菇三萜提取率的影响Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

超声波时间的确定。由图4可知，超声波时长为10～35 min 时，三萜提取率增大，说明次生代谢产物溶出量随细胞破碎而缓慢增高。到35 min，提取率达到峰值；超声时间超过35 min，提取率反而下降，说明超声过长可能会破坏产物。

图4 超声时间对野蘑菇三萜提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

Box-Behnken试验设计。利用单因素试验结果，根据Box-Behnkenz中心组合试验设计原理，用Minitab软件进行试验设计，响应面法各因素及水平见表1。响应面试验设计和结果见表2。

回归模型方差分析结果。以异丙醇体积浓度()、硫酸铵质量浓度()、超声时间()为响应变量，以三萜提取率()为响应值，对表2数据进行多元回归分析，得到多元二次回归方程：=-4810 0+0202 5+10500 0+0073 0-0002 7-25000 0-0002 5+0002 5-0060 0，回归方程的相关系数为0999 2，拟合状况良好，表明回归模型方案可行。由表3可知，模型值小于0.001，说明二次回归模型显著，能够较好地反映值的变化。各因素对值的影响顺序是>>>>>>>。超声时间与超声时间的二次项()、异丙醇体积浓度与超声时间的交互项()对三萜提取率的影响达到极显著水平(<0.01)，异丙醇体积浓度、硫酸铵质量浓度、异丙醇体积浓度二次项、硫酸铵质量浓度二次项对三萜提取率的影响达到显著水平(<0.05)。各交互因素作用对三萜提取率的影响见图5。

表1 响应面试验设计因素水平Table 1 Response surface test design factor level

表2 试验设计和结果Table 2 Test design and results

表3 回归方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

图5 各因素交互作用对野蘑菇三萜提取率影响的响应面Fig.5 Response surface analysis of the interaction of various factors on the extraction rate of triterpenoids in Agaricus arvensis

响应面模型条件优化及验证。利用Minitab软件对回归方程求解，得到三萜提取最佳条件：异丙醇体积浓度45%，硫酸铵质量浓度0.175 g/mL，超声时间35 min，该条件下的提取率为2.94%。为验证该模型的准确性，取异丙醇体积浓度45%，硫酸铵质量浓度0.175 g/mL，超声时间35 min(320 W，4 ℃)，在该条件下做3次平行试验，3次结果的三萜提取率分别为2.83%、2.85%、2.87%，平均提取率为2.84%，与理论预测值的相对误差为3.52%，说明回归方程能较真实地反映各选取因素对三萜提取率的影响，证明应用响应曲面法确定的回归模型可靠。

3 结果与讨论

该研究选用超声辅助异丙醇-硫酸铵双水相系统萃取野蘑菇中的三萜类物质，异丙醇溶于水，硫酸铵作双水相的下相，存在稳定且受温度影响程度小。在使用该方法的提取过程中，三萜在异丙醇-硫酸铵体系中处于异丙醇上相，而除此外的亲水性的淀粉、蛋白质、水溶性糖类、果胶等处于盐水的下相中，既提取了三萜类物质又分离纯化了产品的成分。双水相超声波萃取与常规超声提取法相比，减少了提取时长，更好地保留了产物的完整性。该研究在单因素试验的基础上，通过Box-Benhnken中心组合试验设计，建立了二次回归模型，同时确定双水相超声法提取野蘑菇三萜类化合物的最佳工艺条件为异丙醇浓度45%、硫酸铵浓度0.175 g/mL、超声时间35 min。在该优化条件下，野蘑菇三萜的提取率可达2.84%。经验证，模型合理，能够较好地预测双水相超声法提取野蘑菇三萜类的提取率，为进一步研究野蘑菇的营养价值和应用价值提供参考。