硒化氨基多糖对黑鲷脾脏代谢物的影响

周秀锦，江晓琼，邵宏宏，张 静，冷向阳，杨会成 (.舟山海关综合技术服务中心，浙江舟山 60；.舟山市科学技术局，浙江舟山 60；.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，上海 005；.浙江海洋开发研究院，浙江舟山 60)

黑鲷()因具有广温、广盐性、抗逆性强、生长迅速、肉质好等优点而成为我国东南沿海地区及太平洋西岸海水养殖的经济鱼类。随着海洋经济的不断发展，黑鲷养殖集约化程度越来越高，海水中病原菌种类越来越多，黑鲷的发病率也越来越高。具有噬盐性的副溶血弧菌()广泛附着在海产品表面，是鱼类弧菌病中危害最大的病原菌之一，是海水养殖黑鲷的主要危害因子。目前已有利用添加免疫增强剂的饲料饲喂海水鱼类来防治疾病的文献报道。硒是海鱼机体必需的微量元素之一，它参与体内一些决定性的新陈代谢。通过化学修饰方法将多糖与无机硒结合，获得硒化氨基多糖。硒化氨基多糖的生物活性普遍高于硒和多糖，更易于吸收和利用。目前已有关于硒化氨基多糖作为增强适应性免疫性能潜力的含硒膳食补充剂的报道。目前关于外源硒可以提高黑鲷幼鱼的生长性能和血清免疫活性的相关文献，但关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节机制的研究报道较少。

代谢组学是以组群指标分析为基础、以高通量检测和数据处理为手段、以信息建模与系统整合为目标的系统生物学，可以直接反映机体内生物化学过程和状态的变化，在系统研究生物内源性小分子代谢物的整体和动态变化规律上具有独特优势。目前代谢组学分析技术应用比较广泛的主要有核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术和高分辨质谱(high-resolution mass spectrometers,HRMS)技术2种。NMR技术因具有不损失检测样品且重复性良好等特点而被广泛应用于代谢组学中，检测灵敏度相对较低、不能完全反映代谢组学中的变化是该技术的主要缺点。HRMS技术与色谱联用可获得目标化合物的相对分子量及结构信息，已成为代谢组学研究的主要技术手段。笔者采用高通量、高灵敏度、高分辨率的UPLC-QTOF-MS技术，结合非靶向代谢组学方法，研究硒化氨基多糖调节攻毒后黑鲷免疫力的潜在机制和靶标途径，旨在为黑鲷免疫增强剂的开发提供参考。

1 材料与方法

低聚氨基多糖 (low molecular aminopolysaccharide,LA)分子量约50 ku；自制硒化低聚氨基多糖，其中硒有效含量为27.3 mg/g。黑鲷幼鱼由浙江省海洋水产研究所实验场提供，分组前停饲1 d，将初始体重(13.00±0.20)g的健康黑鲷幼鱼随机分成2组，每组3个重复，每个重复25尾，放入容积310 L(水体积260 L)的玻璃纤维缸内微流水式饲养。试验组饲喂添加0.6 mg Se/kg硒化氨基多糖的饲料，对照组饲喂未添加硒化氨基多糖的饲料，试验期为8 w，饲喂试验结束后停饲，黑鲷腹腔注射0.2 mL副溶血弧菌活菌液(副溶血弧菌在普通营养琼脂培养基上28 ℃下过夜培养，然后用灭菌生理盐水洗脱，稀释到试验所需菌液浓度5.5×10CFU/mL时攻毒，观察黑鲷的健康状况并统计死亡率。对照组黑鲷脾脏分别在饥饿48和96 h时，使用MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐60 mg/L，色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品)麻醉后摘取；试验组在攻毒试验48和96 h时摘取黑鲷脾脏组织，每组10个平行样，称重后液氮快速冷冻，置于-80 ℃超低温冰箱中保存，备用。

参考该课题组前期研究所用代谢组学分析方法进行黑鲷脾脏样品前处理、液相色谱分离、黑鲷脾脏样品中的内源性代谢物检测。利用XCMS结合上海爱博才思分析仪器贸易有限公司(SCIEX)独有的内源性代谢物二级谱库(Metabolite HR MSlibrary，该谱库包含代谢物的分子式、分子量、CAS码、结构式、一级质谱及二级质谱等信息)对质谱采集的数据进行全面的非靶向代谢组学分析。采用XCMS软件进行内源性代谢物的主成分分析(principal component analysis,PCA)，使用MetaboAnalyst 4.0 网站软件在线进行代谢通路分析。

2 结果与分析

黑鲷在攻毒48和96 h时均未发生死亡现象，个别鱼体在攻毒72 h时表现出摄食能力降低、游动相对缓慢，其他临床症状均不明显。在快速分析试验中，采用UPLC分析系统可以获得较高的重现性和分离效果。该试验中醋酸铵和醋酸组合的流动相为大分子代谢物和小分子代谢物提供了最佳的色谱条件。采用2种不同性质的色谱柱对脾脏样品进行分离：极性小的小分子代谢物在T色谱柱上呈现较好的分离，极性大的小分子代谢物则在HILLIC色谱柱上分离效果最好；在正、负离子模式下对对照组、试验组攻毒48和96 h时的脾脏样本进行QTOF-MS/MS分析和数据采集。图1为各组样品典型的总离子流色谱图(total ion chromatograms,TIC)。由图1可知，对照组攻毒48和96 h时黑鲷脾脏的指纹图谱存在一定的差异，表明试验组黑鲷脾脏的内源性代谢物主要组分有明显变化。

注：A.HILLIC、负离子模式；B.HILLIC、正离子模式；C.T3、负离子模式；D.T3、正离子模式；a.对照组；b.攻毒48 h；c.攻毒96 h Note：A.HILLLIC，ESI-;B.HILIC，ESI+;C.T3，ESI-;D.T3，ESI+；a.Control group;b.Virus challenge after 48 h；b.Virus challenge after 96 h图1 不同采集模式下各组样品典型色谱图样品TIC图谱Fig.1 Typical TIC patterns of each group of samples under different acquisition modes

为了考察饲喂硒化氨基多糖后副溶血弧菌活菌液攻毒后黑鲷脾脏代谢物的变化，使用XCMS软件分析在正、负离子模式下采集的高分辨质谱数据，采取主成分分析(PCA)方法自动进行PCA轮廓分析。黑鲷脾脏代谢PCA轮廓分析结果见图2。从图2可以看出，试验组攻毒48和96 h后，与对照组相比，在正、负离子模式下经HILLIC色谱柱和T色谱柱分离的脾脏代谢物主成分均有明显的分离趋势，无交叉和重叠现象，表明试验组在副溶血弧菌攻毒后黑鲷脾脏代谢产物指纹图谱均发生了显著变化。

潜在生物标志物的鉴定方法为试样经色谱柱分离后被离子化为不同质量的离子，进入质谱质量分析器，形成赖以定性的一级和二级质谱信息，通过一级质谱信息可以确定相对分子量，利用二级质谱信息可以获得其结构碎片信息。将经T色谱柱和HILLIC色谱柱分离，在正、负离子模式下的高分辨质谱检测结果，经检索Metabolite HR MSlibrary数据库(SCIEX)发现，饲喂硒化氨基多糖的试验组攻毒48 h时共准确鉴定出31个有显著差异的潜在生物标志物，与对照组相比除甜菜碱水平升高外，30种潜在生物标志物水平呈现明显的降低趋势；攻毒96 h时共准确鉴定出36个有显著差异的潜在生物标志物，与攻毒48 h时相比，除了L-精氨酸和鸟氨酸水平升高外，其他34种潜在生物标志物水平均呈明显下降趋势；在整个试验过程中，4-胍基丁酸和α-亚麻酸呈现先上升(攻毒48 h)后下降(攻毒96 h)的趋势。这表明硒化氨基多糖对黑鲷脾脏具有显著的免疫调节作用。具体结果见表1。

注：A.T3、负离子模式；B.T3、正离子模式；C.HILLIC、负离子模式；D.HILLIC、正离子模式；红色表示攻毒48 h；蓝色表示攻毒96 h；绿色表示对照组 Note：A.T3，ESI-;B.T3，ESI+;C.HILLIC，ESI-;D.HILLIC，ESI+;The red represent virus challenge after 48 h；The blue represent virus challenge after 96 h;The green represent the control group图2 不同采集模式下脾脏代谢分析的PCA轮廓分析Fig.2 PCA profile analysis of spleen metabolic analysis under different acquisition models

表1 非靶向代谢组学分析的差异代谢物

接下表 续表1

根据Metabolite HR MSlibrary数据库检索得出的潜在生物标志物，录入MetaboAnalyst 4.0网站，以鱼为分析模型，进行相关代谢通路分析。经分析发现，副溶血弧菌攻毒48 h时，黑鲷脾脏代谢物中有显著差异的31种潜在生物标志物主要指向8条代谢通路(<0.05)；攻毒96 h时，黑鲷脾脏代谢物中有显著差异的36种潜在生物标志物主要指向10条代谢通路(<0.05)，主要涵盖缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，氨酰转移核糖核酸合成、嘌呤代谢等，具体见表2～3。

脾脏是鱼类的造血组织和重要的外周免疫器官，在其发挥免疫作用的过程中其内源性代谢物也发生相应变化。在整个试验过程中，黑鲷脾脏组织在副溶血弧菌攻毒48和96 h时可鉴定出的代谢物种类和代谢模式明显不同，揭示了其内源性代谢物的种数呈现明显的动态变化。内源性代谢物中氨基酸是构成机体免疫系统的基本结构物质，与免疫系统的组织发生、器官发育以及功能发挥起着重要的作用。该研究试验组黑鲷脾脏中脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸等多种氨基酸的含量明显低于对照组，表明硒化氨基多糖促进了黑鲷机体内的蛋白质和氨基酸代谢；代谢通路分析结果证实14种氨基酸参与了机体免疫，其中谷氨酸和谷氨酰胺在攻毒48 h时参与氨基酰基转移核糖核酸生物合成、嘧啶代谢和嘌呤代谢3条主要代谢通路，在攻毒96 h时参与氨基酰基转移核糖核酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢和组氨酸代谢等5条主要代谢通路。机体内谷氨酸可能是对细胞免疫和体液免疫均有一定抑制作用的潜在抑制剂。谷氨酸的前体是谷氨酰胺，谷氨酰胺通过减少HO的积累、保护DNA免受损害而发挥着重要的抗氧化作用，同时促进了巨噬细胞和淋巴细胞的有丝分裂和分化增殖，增加了机体炎症因子的产生，增强了免疫功能，攻毒后谷氨酸和谷氨酰胺水平呈现下降趋势，提示可能是因为硒化氨基多糖参与了调节脾脏免疫反应；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸属于机体必需氨基酸中的支链氨基酸(BCAAs)，其含量占动物肌肉蛋白质中必需氨基酸含量的35%，具有蛋白质合成、能量产生、神经传递和免疫功能。该研究中试验组脾脏样品中的BCAAs水平在攻毒后均呈现下降的趋势，表明BCAAs通过线粒体的支链氨基转移酶被分解代谢为乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，然后进入三羧酸循环[其中亮氨酸产生乙酰辅酶A(CoA)及乙酰乙酰CoA、缬氨酸产生琥珀酸单酰CoA、异亮氨酸产生乙酰CoA及琥珀酸单酰CoA]，参与机体能量代谢来促进乳酸-葡萄糖的循环和通过促进糖异生保持体内能量平衡，减少乳酸的累积，抑制脑内5-羟色胺的合成，起到缓解肌肉酸痛和延缓疲劳发生发展的效果。该研究黑鲷脾脏内多种氨基酸水平的变化现象表明了硒化氨基多糖对黑鲷脾脏的免疫增强调节功能与氨基酸代谢有密切关系。

甜菜碱具有活性甲基，作为一种直接有效的甲基供体，DNA、RNA、蛋白质和许多其他重要的含甲基(CH)代谢化合物都需要甲基基团。对甲基群代谢和调控的研究表明，甲基供体、代谢与疾病之间存在着显著的相关关系；同时，甜菜碱可以增强细胞的保水能力，可能是通过控制细胞体积、稳定蛋白质和维持细胞膜完整性，保护细胞内酶免受渗透或温度引起的灭活。已有文献报道甜菜碱能降低炎症因子IL-6和TNF-α的表达，具有降低炎症相关疾病发生率的潜力。它们在免疫反应中的重要性可能是由于其在免疫识别和抗体产生过程中发生DNA甲基化，也能改善鱼类红细胞生成、血清蛋白质和脂肪水平、抗氧化状态、免疫功能、神经传递。脾脏内代谢物甜菜碱水平在攻毒48 h时呈相对上调趋势，96 h时呈现下调趋势，提示硒化氨基多糖可能干预了脾脏甲基循环的生化通路，从而增强了黑鲷脾脏的抗病力。

表2 MetPA分析攻毒48 h后的代谢通路分析结果 Table 2 The analysis results of metabolic pathways after virus challenge 48 h by MetPA

表3 MetPA分析攻毒96 h后的代谢通路分析结果 Table 3 The analysis results of metabolic pathways after virus challenge 96 h by MetPA

精氨酸和脯氨酸可转化为鸟氨酸，鸟氨酸攻毒96 h的水平相对上调，其原因可能是副溶血弧菌攻毒后黑鲷机体内蛋白质分解加速，鸟氨酸含量上升，通过鸟氨酸循环的转氨基作用，将毒性较高的-NH转化为低毒的尿素排出体外，同时鸟氨酸参与了谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的生物合成，从而增强黑鲷脾脏的免疫力。在核苷酸代谢过程中，嘧啶、嘌呤等碱基成分对单胺氧化酶的活性具有抑制作用，能够提高活性氧自由基的清除能力，增强小鼠的抗氧化作用。该研究中试验组黑鲷脾脏中嘧啶、嘌呤在攻毒后均呈现下降趋势，说明黑鲷体内的氧化应激状态减弱。

3 结论

该研究采用UPLC-QTOF-MS技术在副溶血弧菌活菌液攻毒后对饲喂硒化氨基多糖的黑鲷脾脏进行了代谢组学研究。分别采用T和HILLIC 2种色谱柱分离结合XCMS方法进行分析，攻毒96 h时筛选出36个有显著差异的潜在生物标志物，经MetaboAnalyst 4.0网站软件分析，饲喂硒化氨基多糖对黑鲷脾脏的10个代谢通路产生了影响。该研究结果表明硒化氨基多糖发挥免疫增强作用与氨基酸代谢存在密切的关系，为今后深入探讨硒化氨基多糖的免疫增强机制和合理开发免疫增强剂奠定了实验基础。