改性扇贝壳粉与壳聚糖复合膜的制备及性质研究

纪登杰，许依能，杨 威，马 洁，王 磊，陈 丽,

（1.江苏海洋大学，江苏连云港 222005；2.江苏海洋大学江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港 222005）

壳聚糖（Chitosan，CTS）是由甲壳素脱乙酰作用得到的一种多糖[1]。以壳聚糖为成分制成的保鲜膜，能够有效减弱呼吸速率、控制水分损失以及抑制微生物等[2-3]。在抑制细菌生长的同时，壳聚糖还可以通过清除机体自由基等作用隔绝食品与空气的接触，从而达到抗氧化效果。壳聚糖因其良好的生物相容性、可降解性和安全无毒等特性，备受关注，具有很高的应用前景[4-7]。但是，单一的壳聚糖膜机械能较差，一定程度上限制了应用范围。为解决这个问题，需要寻求适合的填充材料，改善膜的性能[8-11]。

扇贝是我国重要的优势高值养殖贝类之一，年养殖产量占世界扇贝类年养殖产量的80%以上[12]。扇贝壳资源丰富，其主要成分为碳酸钙，经粉碎后的贝壳粉可以作为良好的无机填充材料加入到有机聚合物中，起到增强韧性的作用[13]。但是将贝壳粉直接应用于有机聚合物时，由于贝壳粉颗粒表面能较大，粉体团聚现象明显，导致在聚合物中分散性能较差[14]。因此，需要对贝壳粉进行表面改性，消除表面高势能，减弱粒子表面极性等方式降低贝壳粉的团聚现象，从而提高聚合物制品的物理性能[15]。

本文探究改性扇贝壳粉的质量分数对壳聚糖复合膜性能的影响，为进一步研究该复合膜在食品保鲜中的应用提供理论基础。开发贝壳资源利用新途径，一定程度上解决了废弃贝壳造成的环境问题，同时还能创造经济效益，促进我国贝壳资源的有效利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜扇贝 购于江苏连云港大润发超市；壳聚糖（脱乙酰度＞95%）、冰乙酸、丙三醇、无水乙醇、硬脂酸钠 国药集团化学试剂有限公司。

DHG-9140A 型电恒温鼓风干燥机 上海一恒科技有限公司；DF-1015 型集热式恒温加热套 上海力辰邦西仪器科技有限公司；KQ-300B 型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XQM-04L 型变频行星式球磨机 南京科析实验仪器研究所；TMSPRO 质构仪 美国FTC 公司；UV-1100 紫外可见分光光度计 上海凌析达仪器公司；Nicolet 5700 傅立叶红外光谱仪 Thermo Electron Corporation；JSM-5610LV 扫描电镜 日本电子（JEOL）；XPERT POWDER 荷兰帕纳科公司。

1.2 实验方法

1.2.1 贝壳预处理 称取一定量的扇贝贝壳，在超声波清洗器内超声2 h，加以清洗除去贝壳表面残余的肉质和附着物，在电恒温鼓风干燥机内300 ℃烘干24 h。将烘干的贝壳进行粉碎机粗粉后，放入球磨机内进行一定时间的球磨得到贝壳粉粉体。

1.2.2 贝壳粉改性步骤 称取一定量的贝壳粉，以1:10 的质量比加入蒸馏水于集热式恒温加热套内加热，加热到一定温度后，加入硬脂酸钠反应，经过一段时间后反应结束，进行抽滤，置于60 ℃下烘干，得到改性贝壳粉。

1.2.3 单因素实验 分别以硬脂酸钠添加量、改性时间、改性温度3 个因素进行单因素实验，以粉体活化度作为衡量指标。

1.2.3.1 硬脂酸钠添加量对贝壳粉改性效果的影响

在改性温度为80 ℃,改性时间为40 min 时，分别添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%的硬脂酸钠，探究硬脂酸钠对贝壳粉改性效果的影响。

1.2.3.2 改性温度对贝壳粉改性效果的影响 在硬脂酸钠添加量为2.5%，改性时间为40 min 时，分别在60、70、80、90、100 ℃下进行改性，考察改性温度对贝壳粉改性效果的影响。

1.2.3.3 改性时间对贝壳粉改性效果的影响 在硬脂酸钠添加量为2.5%，改性温度为80 ℃时，分别在20、30、40、50、60 min 下进行改性，探究改性时间对贝壳粉改性效果的影响。

1.2.4 贝壳粉最佳改性条件优化响应面设计 使用Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计。以硬脂酸钠添加量、改性温度、改性时间3 个考察因素及其变化水平设计三因素三水平响应面方案，试验因素设计如表1。

表1 响应面试验因子水平Table 1 Response surface test factor levels

1.2.5 贝壳粉活化度测定 将贝壳粉置于分液漏斗中，加200 mL 纯化水，反复震荡1 min 后，放于漏斗架上，静置，待其明显分层后将下层贝壳粉放入坩埚中，置于105 ℃恒温干燥箱内干燥至恒重，精确至0.001 g[16]。按下式计算活化度（X）：

式中：X1为样品中漂浮部分的质量；X2为样品总质量。

1.2.6 贝壳粉的结构表征

1.2.6.1 X 射线衍射分析 取一定量改性前后的贝壳粉干燥后进行粉末衍射实验，对贝壳粉晶体结构进行分析。仪器扫描范围20°～60°，扫描速度为1°·min-1[17]。

1.2.6.2 红外光谱分析 将贝壳粉与KBr 粉末按1:100 的质量比在研钵中研磨均匀后，进行红外分析，测定贝壳粉的官能团，仪器扫描范围400～4000 cm-1。

1.2.6.3 扫描电子显微镜分析 取少量改性前后的贝壳粉干燥后均匀平铺在铝片上，喷金，观察贝壳粉的微观结构形貌。

1.2.7 贝壳粉-壳聚糖复合膜的制备

复合膜的制备工艺见图1。称取1.5%（m/v）的壳聚糖溶于冰乙酸1%（v/v）和丙三醇0.6%（v/v）的混合溶液，40 ℃下搅拌至完全溶解。依次按0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的添加量分别加入改性贝壳粉，超声脱气15 min 后，取80 mL 膜液倒入20 cm×20 cm 的亚克力板上流延制膜，置于30 ℃下鼓风干燥，脱膜[18]。实验中以不添加改性贝壳粉的壳聚糖复合膜为空白对照。复合膜中改性扇贝壳粉质量分数以其与壳聚糖的质量比计。

图1 复合膜制备流程Fig.1 Composite film preparation process

1.2.8 复合膜性能测定

1.2.8.1 机械性能测定 采用质构仪测定复合膜的拉伸强度（Ts）和断裂伸长率（EB）[19]。

式中：P 为复合膜断裂时的拉力，N；b 为复合膜的宽度，mm；d 为复合膜的厚度，mm。

式中：L0为复合膜的初始长度，mm；L 为复合膜断裂时的长度，mm。

1.2.8.2 水蒸气透过量（WVTR）测定 在称量瓶中倒入不超过2/3 的纯化水，用复合膜包住瓶口，放于30 ℃干燥器内，每隔12 h 测定1次称量瓶的质量，连续测量3次计算：

式中：Δm 为称量瓶质量损失量，g；A 为称量瓶口膜的面积，m2；t 为时间，h。

1.2.8.3 透光性测定 将复合膜贴在比色皿内，采用紫外-可见分光光度计测定450 nm 下的透光率，以“透光率×厚度”表示测定结果。

1.3 数据处理

以上实验结果平行测定3次。使用Design-Expert 8.0.6 进行响应面设计，实验结果用Origin7.5软件进行统计分析并作图，用Jade 软件对XRD 图谱进行分析。其中P＜0.05 说明差异显著，P＜0.01 说明差异极显著[20-21]。

2 结果与分析

2.1 贝壳粉改性条件的工艺优化

2.1.1 单因素实验

2.1.1.1 硬脂酸钠添加量对贝壳粉活化度的影响在改性温度为80 ℃，改性时间为40 min 的条件下，硬脂酸钠添加量对贝壳粉的活化度的影响如图2所示。贝壳粉的活化度随着硬脂酸钠的增加而提高，当硬脂酸钠增加到2.5%时，贝壳粉活化度最高。继续增加硬脂酸钠添加量时，活化度开始下降。这与雷鹏飞[22]研究的硬脂酸钠用量对碳酸钙原位改性结果趋势一致，由于贝壳粉已经被完全包覆，过量的硬脂酸钠分子与贝壳粉表面长链硬脂酸钠分子发生缠绕作用，使粉体表面的硬脂酸钠分子具有亲水能力的羧基裸露出来，导致贝壳粉活化度的降低。因此，选取2.5%为硬脂酸钠的最适添加量。

图2 硬脂酸钠添加量对改性扇贝壳粉活化度的影响Fig.2 Effect of mass fraction of sodium stearate on activity of modified scallop powder

2.1.1.2 改性温度对贝壳粉活化度的影响 在硬脂酸钠添加量为2.5%，改性时间40 min 的条件下，改性温度对贝壳粉活化度的影响如图3所示。随着改性温度的提升，硬脂酸钠溶解度增加，贝壳粉活化度逐渐提升并在温度为80 ℃时达到最大值。当温度高于80 ℃时，溶剂挥发过快，粉体与改性剂不能充分混合均匀，不利于改性过程的进行，使得粉体活化度逐步下降。因此，选取80 ℃为最佳改性温度。

图3 改性温度对改性扇贝壳粉活化度的影响Fig.3 Effect of modification temperature on activity of modified scallop powder

2.1.1.3 改性时间对贝壳粉活化度的影响 在硬脂酸钠添加量为2.5%，改性温度80 ℃的条件下，改性时间对贝壳粉活化度的影响如图4所示。随着改性时间的增加，贝壳粉浆液中的Ca2+、CaOH+等组分与硬脂酸钠RCOO-反应较为充分，硬脂酸钠对贝壳粉较快包覆，粉体活化度提高。覃筱燕[23]也研究了相关对生蚝壳粉改性效果实验，她发现在不同的改性温度下贝壳粉体活化度呈现先升高后略有降低的的趋势。当温度超过一定数值时，由于长时间的搅拌，导致贝壳粉表面少量硬脂酸钠的脱落，使得改性效果变差。因此，选取40 min 为最佳反应时间。

图4 改性时间对改性扇贝壳粉活化度的影响Fig.4 Effect of modification time on activity of modified scallop powder

2.1.2 响应面试验设计结果 在单因素实验基础上，以硬脂酸钠添加量、改性温度、改性时间为变量，以活化度为响应值，设计响应面分析试验，试验结果见表2 和表3。

表3 响应面方差分析结果Table 3 Analysis of variance results of response surface test

用Design Expert 8.0.6 软件对表2 中的响应值进行多元二次分析，得到贝壳粉活化度的回归模型方程如下：

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface test results

该方程的R2为98.9%，模型达到显著水平（P＜0.0001），失拟项不显著，表明该模型拟合性能良好、方法可靠。模型的R2=98.9%，说明响应值变化的98.9%与选择的变量相关，模型校正决定系数R2Adj=0.9750，表明此回归方程可以表示响应值变化具有可行性。

根据以上回归方程绘制响应面交互作用曲面图，研究硬脂酸钠添加量、改性温度、改性时间三个因素对贝壳粉活化度的影响，响应面如图5～图7。

硬脂酸钠添加量、改性温度、改性时间对贝壳粉活化度的影响趋势可以通过图5～图7 直接得出，改性时间对贝壳粉活化度的影响较大，表现为较陡曲线；硬脂酸钠添加量、改性温度对贝壳粉活化度的影响较小，曲线相对平滑。通过软件分析，确定贝壳粉最佳改性条件：硬脂酸钠添加量为2.53%，改性温度为80.70 ℃，改性时间为43.19 min，在此条件下贝壳粉的活化度为76.33%。在此条件下，重复3次贝壳粉改性实验，此时的贝壳粉的活化度为76.41%±0.3%，与模型预测结果基本相同，说明该模型能够较好的模拟贝壳粉改性过程和预测贝壳粉的活化度。

图5 改性温度和硬脂酸钠添加量对贝壳粉活化度的交互影响Fig.5 Interactive effects of modification temperature and amount of sodium stearate on the activity of shell powder

图7 改性时间和改性温度对贝壳粉活化度的交互影响Fig.7 Interactive effects of modification time and temperature on the activity of shell powder

2.2 改性贝粉的表征

2.2.1 贝壳粉XRD 分析 图8所示是扇贝壳粉和改性扇贝壳粉的XRD 图，利用jade 软件检索分析，扇贝壳粉的XRD 图中23°、29°、36°、39°、43°、47°、49°处的7 个衍射峰分别对应方解石型碳酸钙的（012）、（104）、（110）、（113）、（202）、（018）、（116）7 个晶面。改性扇贝壳粉的XRD 图谱与之相比，也出现了方解石的7 个衍射峰，说明经硬脂酸钠对贝壳粉的改性只是改善扇贝壳粉的疏水性，并没有破坏扇贝壳粉的晶体结构，因此不会影响扇贝壳粉的原有性质[24]。

图6 改性时间和硬脂酸钠添加量对贝壳粉活化度的交互影响Fig.6 Interactive effects of modification time and amount of sodium stearate on the activity of shell powder

图8 改性扇贝壳粉XRD 图谱Fig.8 XRD pattern of modified scallop powder

2.2.2 贝壳粉改性前后的FT-IR 分析 为证明改性成功，以未改性的扇贝壳粉作为实验的对照组，图9表示扇贝壳粉改性前后的红外光谱图。从图9可知，未改性的扇贝粉在713 和873 cm-1处有较大的峰，分别对应着面外变形振动峰，O-C-O 面内变形振动的吸收峰，为碳酸钙方解石晶型的特征峰。1500 cm-1处有一个较宽的峰，这是碳酸根的特征峰，2500 cm-1附近为质子化形态的伸缩振动吸收峰[25]。3440 cm-1的宽吸收峰，是由于贝壳粉微粒表面的羟基和吸附水的存在造成的H-O 键的对称伸缩振动和不对称伸缩振动。与未改性的扇贝壳粉相比，用2.5%的硬脂酸钠改性后的扇贝粉在2850 和2917 cm-1处出现了特征峰，这两个特征峰对应的是-CH3和-CH2伸缩振动吸收峰，这说明改性后的扇贝粉表面存在CH 化合物，实验结果表明硬脂酸钠成功包覆在扇贝粉表面[26-27]。

图9 改性扇贝壳粉红外图谱Fig.9 Infrared spectrum of modified scallop powder

2.2.3 贝壳粉改性前后的SEM 分析 利用发射扫描电子显微镜对贝壳粉进行观察，贝壳粉的SEM 照片如图所示。从图10a 中可知，经过行星式球磨机细粉后的扇贝粉团聚现象非常明显，其中纤维状结构的方解石型碳酸钙最多，相互交错团聚一块。从图10b中可知，经过硬脂酸钠改性后的扇贝粉颗粒，团聚现象明显减弱，颗粒与颗粒之间间隔较大。粉体经过改性后得到了很好的分散效果[28]。

图10 扇贝壳粉改性前后SEM 图谱Fig.10 SEM of modified scallop powder

2.3 贝壳粉-壳聚糖复合膜理化性质分析

2.3.1 改性贝壳粉质量分数对复合膜机械性能的影响 改性扇贝壳粉添加量对复合膜机械性能的影响如图所示。由图11 可以看出，随着改性扇贝壳粉添加量的增加，贝壳粉与壳聚糖复合膜的拉伸强度（Ts）缓慢提升，当贝壳粉添加为1%时，复合膜的拉伸强度达到最大；继续增加贝壳粉添加量，复合膜的拉伸强度降低。由图12 可以看出，当改性扇贝壳粉添加量在0.5%时，复合膜断裂伸长率达到最大，之后随着贝壳粉的添加量增加而逐步下降[29]。

图11 改性扇贝壳粉质量分数对复合膜拉伸强度的影响Fig.11 Effect of mass fraction of modified fan shells powder on tensile strength of composite membranes

图12 改性扇贝壳粉质量分数对复合膜断裂伸长率的影响Fig.12 Effect of mass fraction of modified fan shells powder on the breaking elongation of composite membranes

分析认为，改性扇贝壳粉添加量较少时，贝壳粉粒子在复合膜中均匀分布，且经改性后的贝壳粉体亲水性能降低，与壳聚糖相容性更好，进而改善了两者间的粘合状态和应力的传递，促进了机械性能的改善[30]。当改性贝壳粉添加量过高时，贝壳粉体粒子间团聚作用加巨，使其在壳聚糖溶液中分布不均，导致复合膜拉伸强度降低。李金星等[9]在研究壳聚糖复合膜时发现甘油具有较强的亲水性，甘油中的羟基能够与壳聚糖分子中的羟基结合形成链间氢键，导致壳聚糖分子内部间的作用力减小，使复合膜更加柔软，而复合膜的断裂伸长率受柔韧性的影响。韩英等[31]在研究碳酸钙壳聚糖复合膜时发现，碳酸钙与壳聚糖分子发生氢键作用，壳聚糖分子间连接点减少，减弱了分子间作用力，所以随着贝壳粉添加量的提高，壳聚糖分子之间的连接点减少，复合膜的柔韧性增强；当改性扇贝壳粉添加量过大时，贝壳粉体、甘油和壳聚糖连接位点形成大量链式氢键，使得复合膜韧性降低刚性增强，因而断裂伸长率降低。

2.3.2 水蒸气透过量 如图13所示，随着改性扇贝壳粉质量分数的增加，水蒸气透过量逐步降低，当未加入改性扇贝壳粉时可能由于单一壳聚糖空隙较大，结构较为松散，导致水蒸气透过量较大。通过李金星等[9]与韩英等[31]对壳聚糖复合膜的研究发现甘油、贝壳粉与壳聚糖分子以氢键结合，这促使分子紧密排列，改善了壳聚糖分子间结构，因而降低了复合膜水蒸气透过量。

图13 改性扇贝壳粉质量分数对复合膜水蒸气透过量的影响Fig.13 Effect of mass fraction of modified fan shell powder on water vapor transmission of composite membrane

2.3.3 透光性 复合膜的透光性反映了壳聚糖与改性贝壳粉分子间的相容性，分子间相容性越好，复合膜透光性越大。由图14 可以看出，随着改性贝壳粉质量分数的增加，复合膜的透光性先增加后降低，当改性贝壳粉质量分数为1.5%时，粉体粒子与壳聚糖相容性最好，粉体均匀分散在复合膜中，此时复合膜的透光性能最好。当改性贝壳质量分数超过1.5%时，在改性贝壳粉/壳聚糖复合液超声过程中，贝壳粉体粒子碰撞几率增大，导致部分粉体团聚，复合膜界面因光的折射和散射作用，致使透光性降低[30]。

图14 改性扇贝壳粉质量分数对复合膜透光性的影响Fig.14 Effect of mass fraction of modified fan shell powder on light transmittance of composite membrane

3 结论

本实验以硬脂酸钠为改性剂，通过单因素实验和响应面试验分析改性温度、硬脂酸钠质量分数、改性时间对扇贝壳粉活化度的影响，并确定了最佳的反应条件：硬脂酸钠添加量2.53%，改性温度80.70 ℃，改性时间43.19 min，在此条件下改性扇贝壳粉活化度可以达到76.41%。随后对改性扇贝壳粉的进行表征实验，对其在晶体结构、基团和微观结构对粉体进行分析并确定改性实验的成功。

随后采用流延法制备了改性扇贝壳粉与壳聚糖的复合膜，以不添加改性扇贝壳粉的壳聚糖复合膜为对照。结果表明，当改性扇贝壳粉质量分数为1%时，复合膜拉伸强度最大，水蒸气透过率降低，透光性提高，此时改性扇贝壳粉粒子与壳聚糖分子的相容性较好。

本文对贝壳利用方式进行探索，以资源量丰富的扇贝壳作为复合膜材料来源，为进一步研究改性扇贝壳粉/壳聚糖复合膜在食品保鲜中的应用提供基础研究。