刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应条件的优化

蔡爱丽，黄名勇，王 政，呙亚波，赵 倩, ，邓洁红,

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙 410128；2.湖南省天香生物科技有限责任公司，湖南邵阳 422000）

刺葡萄是葡萄科葡萄属植物，木制藤本[1]。刺葡萄来源广泛，价格低廉，但果粒小、种子多，不便鲜食，是优秀的加工原材料[2]。紫黑色的刺葡萄果皮中含有大量的纯天然锦葵色素，为花色苷单体，具有保健功效和巨大的应用潜能[3-6]。花色苷作为一种水溶性色素，在日常环境中稳定性差，易分解变色[7]，容易受温度[8-9]、光照[10-11]、pH[12-13]等外界因素的影响，不能用于工业化大规模生产。锦葵色素属于类黄酮化合物[14]，分子结构上含有多个活泼羟基[15]，使其稳定性受到影响。羟基数量越多，锦葵色素的稳定性越低。而酰化的花色苷的结构具有空间位阻效应，能减少水解反应和花色苷的分子内凸起，防止花色苷转化成假碱和查尔酮结构，从而提高其稳定性[16-18]。

研究者一般通过化学法实现花色苷酰基化[19-20]，改善花色苷稳定性和脂溶性。但由于花色苷结构中的活性羟基均能酰基化，化学法选择性低，易与母核上的主要活性酚羟基结合或阻断，导致削弱甚至丧失原有的抗氧化活性[21]。此外，采用化学法酰化时，产物难以分离纯化；且反应较为剧烈且有毒，会造成环境污染等[22-23]。近年，有学者针对花色苷酶促酰化开展了研究[18,24]，发现酶促酰化的反应条件比较温和，酰化位点明确，酰化产物单一，纯度较高，弥补了化学法酰化反应存在的缺陷[25]。同时，酶的高效性和选择专一性，可大大提升底物酰化反应的酰化率。通过酰化反应，能提高花色苷的抗氧化性[26]、脂溶性[27]和稳定性[28-29]。

目前，花色苷酶促酰化的文献大多采用矢车菊3-O-葡萄糖苷作为研究对象，锦葵色素的酶促酰化未见报道。研究表明，酰基供体和反应条件的选择不当会导致转化率相当低[30]。因此，探寻刺葡萄锦葵色素酰化反应的最适条件，对提高刺葡萄的利用率及其工业价值是非常重要的。本研究以刺葡萄为试验原材料，刺葡萄中锦葵素-3,5-O-双葡萄糖苷为反应底物，以酰化率作为评价指标，得到酶促酰化的反应时间、反应温度、底物摩尔比的最佳反应条件区间；以此为基础，设计响应面优化试验，对建立的刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应体系进行反应参数的优化，得到最佳反应条件，为锦葵色素的稳定化及工业利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺葡萄 从中方县刺葡萄果园基地购回，用自来水冲洗干净，晾干后剥皮，在-20 ℃冰箱中冷冻贮藏；锦葵啶-3,5-双葡萄糖苷标准品 德国Phyto Lab公司；脂肪酶Candila Antarctica-B（CAL-B，Novozym 435） 诺维信生物技术有限公司；叔丁醇、月桂酸乙烯酯 分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分子筛4A 型（工业级）、甲醇、乙醇、盐酸、乙醚、乙酸乙酯 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

AEY-220 电子分析天平 湘仪仪器设备有限公司；HJ-4A 恒温磁力搅拌器 上海比朗仪器有限公司；e2695 高效液相色谱仪 美国Waters 公司；RE-2000B 旋转蒸发仪、SHZ-D 循环水式真空泵 予华仪器有限责任公司；THZ-92A 气浴恒温振荡器、HH-8 恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器厂；真空冷冻干燥机 丹麦Heto 公司；TDZ5 离心机 湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 刺葡萄锦葵色素单体的制备 参照课题组前期试验成果[31]，制备刺葡萄锦葵色素-3,5-O-双葡萄糖苷（Malvidin-3,5-O-diglucoside）。

提取：刺葡萄果皮以1:4（g/mL）的料液比加入75%酸化乙醇（含0.03%盐酸），在避光环境下，浸提24 h 真空浓缩后离心，经过2次无水乙酸乙酯和无水乙醚萃取，脱除有机溶剂，得到锦葵色素粗提液。

纯化：HP-20 树脂预处理后湿法装柱，锦葵色素粗提液进样至流出液的吸光度值为上样液的1/10。首先用蒸馏水冲洗, 再用体积分数为80%、含0.05%盐酸的酸化乙醇洗脱，收集洗脱液于40 ℃浓缩，真空冻干，再用甲醇溶解。

单体制备：通过半制备型高效液相制备，色谱条件：柱子：XCharge C18柱（20 mm×250 mm，10 μm）；检测波长：520 nm；流动相A：2%甲酸溶液；流动性B：甲醇；进样量：1.2 mL；流速：15 mL/min；柱温：30 ℃；洗脱程序：0 min：30% B，5 min：35% B，8 min：40%B，12 min：50% B，18 min：60% B，20 min：80% B。

参考文献[31]进行结构鉴定，获得3 种色素，经过超高效液相色谱三重四级杆飞行时间质谱联用分析鉴定选取锦葵素-3,5-O-双葡萄糖苷为试验单体。

1.2.2 脂肪酶催化花色苷酰化反应

1.2.2.1 反应时间对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响 将活化后的4A 型分子筛放入叔丁醇中进行干燥，在5 个带塞小瓶中加入2 mL 脱水叔丁醇、0.01 mmol 锦葵素-3，5-O-双葡萄糖苷、0.10 g 分子筛和0.15 mmol 月桂酸乙烯酯混合均匀，连续搅拌至完全溶解，加入40 mg 脂肪酶CAL-B，pH 为3.0 时在恒温振荡器（45 ℃，200 r/min）中分别反应24、30、36、42、48 h 后，5000 r/min 离心15 min 后取上清液，将滤液置于旋转蒸发仪中，真空蒸馏后，溶解于10 mL 的甲醇中，搅拌至完全溶解后，12000 r/min离心10 min，取上清液。用体积分数为0.01%的甲酸甲醇溶液稀释50 倍，液相色谱手动进样20 μL 进行分析。酰化反应前后，试验均在避光条件下进行。利用归一法计算出峰面积，获得反应的酰化率，探讨反应时间对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响。

1.2.2.2 反应温度对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响 按照1.2.2.1 的方法，将锦葵色素的酰化反应温度分别设置为40、45、50、55、60 ℃，反应42 h后终止反应。经液相色谱分析后计算反应的酰化率，探讨反应温度对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响。

1.2.2.3 底物摩尔比对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响 按照1.2.2.1 的方法，在锦葵色素酰化反应过程中分别添加0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol的月桂酸乙烯酯，使底物的摩尔比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，55 ℃下反应42 h。经液相色谱分析后计算反应的酰化率，探讨底物摩尔比对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响。

1.2.2.4 响应面优化试验 以单因素实验为基础，反应时间、反应温度、底物摩尔比为试验因素，以酰化率为响应值，根据Box-Benhnken 原理，设计响应面优化试验，因素水平表如表1所示。每组试验重复三次，通过Design-Expert V8.0.6 软件，通过数据分析得到试验最优条件方案。

表1 响应面优化试验因素水平设计Table 1 Design of factors and levels of response surface optimization test

1.2.3 酶促酰化反应酰化率的计算 酰化反应后，利用高效液相色谱仪进行分析。分析条件如下：

流动相A：1%甲酸溶液；流动相B：乙腈；流速：0.6 mL/min；柱温：35 ℃；检测器：PDA 紫外检测器；检测波长：520 nm；进样量：20 μL。

低压梯度洗脱条件：0 min：5% B，5 min：20% B，20 min：90% B，30 min：90% B，45 min：20% B。

花色苷的酰化率计算公式为：

式中：S1表示反应后酰化产物的峰面积；S0表示反应后未酰化花色苷的峰面积。

1.3 数据处理

试验设重复实验，以平均值±标准偏差表示结果。使用Origin 2017 64 Bit 软件进行数据绘图，用SPSS 21.0 软件对试验数据进行多重差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酰化反应前后的高效液相色谱分析

利用高效液相对酶促酰化反应前后的刺葡萄锦葵色素进行分析。从图1A 可看出，未酰化花色苷单体在520 nm 检测只有一个色谱峰，计算出制备的刺葡萄锦葵色素单体纯度为98.76%。图1B 为酰化反应后花色苷的液相色谱图，在520 nm 可以检测到两个色谱峰，与未酰化的色谱图相比，多了一个酰化产物峰。这说明刺葡萄锦葵色素酰化反应可能生成了单酰基产物，脂肪酶催化区域选择性较高，只有一个酰化位点，能更好地分离纯化出酰化花色苷单体。通过酰化产物的峰面积确定酶促酰化反应的酰化率，证明酶促酰化反应的转化率。

图1 酰化反应前后样品的液相色谱图Fig.1 Liquid chromatographic of the sample before and after the acylation reaction

2.2 反应条件对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响

如图2A所示，随着酰化反应时间的增加，酰化率先提高后降低。酰化反应时间为24～42 h 时，锦葵色素中酰基供体的浓度较高，酰化产物浓度较低，促进反应向正方向进行，酰化率从29.8%提高到43.2%。但是，反应时间达到42 h 后，酰化反应基本达到平衡状态，且刺葡萄锦葵色素及酰化产物长时间处于高温下发生分解，酰化率降低。因此，选取反应时间36、42、48 h 为最优梯度。

酶促酰化反应容易受到温度的影响。在一定温度范围内，升高温度能增加底物分子能量和活化的底物分子，相应增加了单位时间内底物分子有效碰撞次数，从而促进反应的进行。如图2B所示，反应温度低于55 ℃时，脂肪酶CAL-B 的活性、底物的溶解度以及反应体系中底物有效碰撞次数都随着反应温度的提高而增多，酰化效率也随之提高。在55 ℃时，锦葵色素的酰化率最高，继续升高反应温度，酰化效率开始降低。因为当温度过高且在有机溶剂中时，肽键的水解和二硫键的破坏被加剧，脂肪酶的酶蛋白会发生变性最终失活[32-33]。同时，温度过高导致了锦葵色素及其酰化产物的降解[34]。因此，选取反应温度50、55、60 ℃为最优梯度。

刺葡萄锦葵色素酶促酰化体系属于双底物可逆反应，反应中同时存在酶促水解副反应[35]。在酰化反应体系中，加入过量的酰基供体，能够提高反应体系中底物与脂肪酶之间的碰撞，从而提高反应的酰化率。同时提高双底物中一种底物的浓度，有利于热力学平衡向酰化反应的方向进行。因此，最佳摩尔比的确定，既能保证反应充分发生，同时也能节省试剂。底物摩尔比对酰化率的影响结果如图2C所示，当刺葡萄锦葵色素与月桂酸乙烯酯的摩尔比从1:10～1:25时，刺葡萄锦葵色素的酰化率逐渐升高，继续提高月桂酸乙烯酯的浓度，脂肪酶的活性受到影响，反应的酰化率开始降低。综合考虑，选取底物摩尔比1:20、1:25 和1:30 为最优梯度。

图2 反应条件对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的影响Fig.2 Effects of reaction conditions on the enzymatic acylation of malvidin

2.3 响应面优化试验结果分析

对反应时间（A）、反应温度（B）、底物摩尔比（C）三个因素进行反应条件优化，通过单因素实验，选取每个因素的最优梯度，以酰化率为响应值进行三因素三水平的响应面优化试验，共设计17 个试验，每个试验设三个平行，Box-Behnken 试验设计与结果见表2。

表2 响应面优化试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface optimization test

2.4 回归方程方差分析

通过Design-Expert V8.0.6 软件对数据进行多元回归拟合，得到刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应酰化率Y（%）的二次多元回归方程：

Y=49.96+0.3125A-0.9500B-0.4625C-1.65AB-1.48AC-0.2500BC-3.14A2-3.37B2-2.24C2。

以刺葡萄锦葵色素的酰化率为响应值，对三个因素（反应时间、反应温度、底物摩尔比）的回归方差分析结果如表3所示。该回归方程模型回归极显著（P＜0.0001），且失拟项不显著，说明该模型拟合程度好。函数的决定系数R2=0.9818，说明该模型可以解释大部分试验数据，因此可以用该模型预测和分析不同反应时间，反应温度和底物摩尔比对刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应体系酰化率的影响。

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Regression equation analysis results

由P值可以看出，反应时间（A）和反应温度（B）的影响极显著（P＜0.01），底物摩尔比（C）影响不显著，二次项A2、B2、C2极显著（P＜0.01）。AB、AC的P值均小于0.01，说明反应时间与反应温度、反应时间与底物摩尔比交互作用对酰化率的影响极显著。

2.5 响应面因素交互作用分析

响应面等高线图及响应图，反映了试验因素之间的交互作用，响应曲面越陡峭，因素对响应值的影响越显著；而响应面投射出的等高线形状，如果呈椭圆形则表示两因素交互作用显著，如果接近圆形则表示两因素交互作用不显著。

由图3A可知，在底物摩尔比不变的情况下，反应时间在36～48 h，反应温度在50～60 ℃范围内，刺葡萄锦葵色素的酰化率先升高后降低，且等高线图呈椭圆形，三维曲面图较陡峭，说明两者之间的相互影响显著，得到的结果与回归方程分析中AB 的P值一致。由图3B可知，在反应温度不变的情况下，反应时间在36～48 h，底物摩尔比在1:20～1:30 范围内，刺葡萄锦葵色素的酰化率先升高后降低，且等高线图呈椭圆形，三维曲面图较陡峭，说明两者之间的相互影响显著，得到的结果与回归方程分析中AC的P值一致。而图3C 中，等高线图呈圆形且三维曲面图较平缓，说明反应温度与底物摩尔比之间的相互影响不显著。

图3 各因素交互作用的等高线图及响应图Fig.3 Contour diagram and response diagram of interaction of various factors

2.6 响应面最佳反应参数及验证试验

经Design Expert 优化后的刺葡萄锦葵色素酶促酰化反应的最佳反应条件为反应时间42.75 h、反应温度54.16 ℃、底物摩尔比1:24.32，此条件下酰化率预测为50.09%，结合试验可行性，将反应条件调整为反应时间43 h，反应温度54 ℃，底物摩尔比1:24。该条件下进行三次重复验证试验试验，得酰化率为49.92%±0.12%，与预测酰化率的相对误差为0.12%。

3 结论

本文首先以刺葡萄锦葵色素的酰化率为指标，分别探讨反应时间、反应温度和底物摩尔比对酶促酰化反应的影响。其次通过响应面优化试验，进行回归方程方差分析，结果显示回归方程模型回归极显著（P＜0.0001）。最终，根据所建立的数学模型进行参数最优分析，得到最佳反应条件，结合试验可行性，确定最佳反应时间为43 h，反应温度为54 ℃，底物摩尔比为1:24 时，刺葡萄锦葵色素的酶促酰化反应的酰化率为49.92%±0.12%，与模型预测值50.09%的相对误差为0.12%，说明该反应条件合理可靠。本研究为天然花青素酰化研究提供了新的数据，为其在食品和保健品中的应用提供了依据。但是，酶促酰化反应位点对花色苷稳定性及抗氧化活性的影响还需要更加深入的探索。